Um método eficiente de crivagem para isolar intactos glomérulos do rim de rato adulto

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Pittsburgh e institucional Cuidado Animal. 1. isolamento de rato glomérulos Para preparar um buffer de isolamento de 1% estéril, adicione 5 g de albumina de soro bovino (BSA) para um béquer de 600 mL. Adicionar 500 mL de 1x salina tamponada fosfato (PBS) para o copo e mexa com uma vara de agita magnética até todos BSA é dissolvido. Filtro estéril o buffer de BSA/PBS de 1% em uma capa de cultura de células.Nota: O buffer de BSA/PBS estéril 1% pode ser mantido a 4 ° C por até uma semana. Obter ratos Sprague-Dawley de 2 a 4 pesando 150 a 200 g cada. Eutanásia em ratos através de dióxido de carbono por inalação usando uma câmara em que 100% de dióxido de carbono é introduzido em uma taxa de 10-30% do volume da câmara por minuto. Observar os animais, pela cessação da respiração e desvaneceu-se a cor dos olhos antes da remoção de dióxido de carbono. Prepare a pele ao longo do abdômen anterior com 70% de etanol e utilizar a máquina de cortar cabelo para remover o cabelo, se desejado. Fazer uma incisão na pele usando uma tesoura cirúrgica ou bisturi. Fazer outra incisão através da camada muscular para expor os órgãos internos. Estenda a incisão superiormente pelo diafragma e esterno ou caixa torácica como um método secundário de eutanásia. Isolar e remover ambos os rins e colocar em um tubo cônico de plástico estéril 50 mL com 30 mL de sal solução tamponada Hanks (HBSS) no gelo.Nota: Vários ratos podem ser sacrificados na mesma Câmara e todos os rins podem ser colocados no mesmo tubo cónico. Manter os rins em gelo e transporte para uma capa de cultura de células estéreis. Transferir os rins para uma placa de Petri estéril contendo 5 mL de HBSS, também com gelo e remover e descartar gordura perirrenal com tesoura e pinça em ponto. Se ainda está presente, também remover e descartar a cápsula ao redor do rim, fazendo uma pequena incisão superficial e use Pinças afiadas delicadamente puxá-lo longe do órgão.Nota: Sempre rim isolados no gelo e prática técnica estéril durante todo. Um pedaço de gaze estéril pode ser colocado na caixa de Petri como uma superfície texturizada para segurar o rim no lugar durante a manipulação. Corte os rins ao meio longitudinalmente (secção sagital) e remover e descartar a medula (que é de cor mais escura) com um bisturi em uma segunda placa de Petri com 5 mL de HBSS. Transferir as peças restantes, que são predominantemente córtex renal, para um terceiro tubo de ensaio com 5 mL de HBSS e picar com uma lâmina de barbear estéril até que as peças são menos de 1 mm de tamanho, ou até um colar é formado. Molhar a parte superior e inferior de uma peneira de 180 µm com 1% BSA/PBS sobre um copo de resíduos de 500 mL. Este passo é fundamental pois reveste a peneira com proteína e reduz a aderência dos glomérulos, que irá melhorar o rendimento. Coloque o córtex picado sobre uma pequena borda da peneira e use o flange de êmbolo texturizada (do lado oposto a vedação de borracha) de uma seringa de 10 mL para embaralhou o tecido através da peneira em uma panela de fundo sentado no gelo. Lavar periodicamente com HBSS, mas usar o mínimo possível para evitar a diluição da amostra.Nota: Não ultrapasse 30 mL do total da reserva, tão somente de 25 mL, mais podem ser usado aqui. A razão para a colocação do tecido picado de apenas um lado da peneira é reduzir a aderência dos glomérulos, limitando a exposição de parte da peneira ao invés de área de superfície inteira da peneira. Para facilitar isso, reutilize o líquido coleta na panela para enxaguar a peneira inferior. Concluído o peneirar, Lave cuidadosamente a parte inferior da peneira mais uma vez com o tampão de BSA/PBS 1% do fundo da panela para capturar qualquer glomérulos que podem ser livremente aderiu. Coletar todos os fluidos na panela inferior em várias seringas de 10 mL, equipadas com agulhas de 20 G e passá-lo através da agulha de pelo menos 2 vezes adicionais. Na última coleção, manter o fluido contendo glomérulos na seringa até estar pronto para passá-lo pela peneira 90 µm. Enquanto o fluido é armazenado nas seringas, lave a panela de fundo por lavagem com 1% BSA/PBS em copo de resíduos e molhado no topo e no fundo de uma peneira de 90 µm com 1% BSA/PBS. Coloque a peneira em cima da panela de fundo no gelo. Aplique a amostra em seringas de uma borda da peneira e pirão através da peneira com outro flange seringa como descrever acima. Lave com solução da bandeja inferior para recolher tudo numa ponta da peneira. Uma vez peneirando é completa, lavar cuidadosamente a parte inferior da peneira etapa 1.5.1. Recolha todo o líquido na panela inferior em um tubo cônico plástico de 50 mL. Lave a panela de fundo com 1% de BSA/PBS em um copo de resíduos e molhado a parte superior e inferior da peneira 75 µm com 1% BSA/PBS. Coloque a peneira em cima da panela de fundo no gelo. Aplique a amostra uma borda da peneira. Líquido deve fluir facilmente. Lavar com a parte superior com pelo menos 20 mL de 1% BSA/PBS matraz de resíduos. Lave cuidadosamente o fundo da peneira também. Os glomérulos permanecerá no topo desta peneira 75 µm. Use HBSS para coletar glomérulos em uma placa de Petri enxaguando pela peneira de cabeça para baixo. Use tanto HBSS conforme necessário aqui. Colete em um ou mais 50 mL plástico tubos cónicos no gelo. Centrifugar a 1800 x g por 5 min a 4 ° C, remover o sobrenadante com uma pipeta e resuspenda o pellet em 10 mL de HBSS frio. Combine as amostras se vários tubos cónicos foram coletados em 1.7.2. Repita a etapa de centrifugação. Resuspenda os glomérulos em 5 mL de HBSS até estar pronto para prosseguir para a próxima etapa. Se desejar, leve uma contagem de glomérulos totais. Para isso, leve uma amostra de 10 µ l com uma pipeta e coloque a gota em uma lâmina de vidro. Visualizar sob um microscópio, contar os glomérulos no campo e multiplique por 500 para obter rendimento total.Nota: A pureza pode ser determinada pela contagem do número de túbulos visto no campo e dividindo pelo número total de glomérulos e túbulos estruturas. Deve haver > 95% de glomérulos no campo visual. Se houver contaminação significativa tubular, repita as etapas 1.6.1 em diante e certifique-se de lavar cuidadosamente quando completar passo 1.7.1. Esta é a etapa na qual tubular contaminação é mais provável de ocorrer. 2. a lesão dos glomérulos Colete os glomérulos em um plástico tubo cônico de 15 mL e spin para baixo em 200 x g. Ressuspender em uma quantidade adequada de HBSS baseia o rendimento total que existem aproximadamente 9.000 glomérulos por alvéolo. Pipetar 450 µ l de amostra para cada poço de uma placa de 24, ou qualquer formato de placa que se encaixa os jusante ensaios necessários.Nota: Pipetagem acima e para baixo para misturar glomérulos no buffer garante uma solução homogênea. Os glomérulos são muito pegajoso e pesado e vão enfiar uns aos outros bem como acertar na parte inferior de uma solução rápida e para os lados do tubo. Para tornar a protamina 6 mg/mL de sulfato solução (PS), primeiro dissolva 1 g de PS em 10 mL de dH2O aquecida a 40 ° C em um plástico tubo cônico de 15 mL e vórtice completamente. Tome 30 µ l da solução e adicione a 470 µ l de dH2O.Nota: Isto irá produzir uma solução de 6 mg/mL, e quando 50 µ l são adicionados ao poço, conforme descrito abaixo, a concentração final é de 0,6 mg/mL. Em duplicado, adicionar 50 µ l de sulfato de protamina (este é um 01:10 diluição) para cada poço de um grupo, ao fornecer outro µ l do grupo 50 de HBSS (controle negativo). Incubar a placa por 4 h a 37 ° C. Spin para baixo conteúdo de cada poço em um tubo de microcentrifugadora (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) e lavar duas vezes com 1 mL de PBS cada. Aspirar fora a lavagem final e ressuspender em 300 µ l de PBS. Dividido em três alíquotas de estar preparado para o isolamento da proteína, visualização de transmissão microscópio de elétron (TEM) e imunofluorescência (IF) de coloração. 3. preparar glomérulos para análise Spin para baixo o conteúdo das três alíquotas (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) e aspirado de fora o restante do buffer e proceder à análise da amostra pela TEM, se, ou isolamento da proteína. Processamento para TEM Corrigi pelotas glomerulares em 150 µ l de frio glutaraldeído 2,5% em PBS de 0,01 M. Retire cuidadosamente o fixador a pelota com uma pipeta Pasteur, certificando-se para não perturbar a pelota, e depois enxaguado com PBS e pós-corrigi-lo em tetróxido de ósmio 1% com 1% de ferricianeto de potássio. Desidratar a amostra através de uma série graduada de etanol (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) e óxido de propileno em seguida incorporar em epóxi incorporação material. Corte semi fina (300 nm) seções sobre um ultramicrotome. Mancha com 0,5% de azul de toluidina em borato de sódio 1% e examiná-las sob o microscópio de luz. Corte de seções ultra-finas (65 nm), mancha-las com acetato de uranilo e citrato de chumbo de Reynold e examinar em um microscópio eletrônico de transmissão. Processamento para se Adicionar 150 µ l de uma gelatina de 12% em solução de PBS e colocar imediatamente em gelo seco para formar um pellet. Mergulhe a pelota em 500 µ l de 2% paraformaldeído/1 x PBS em um tubo de microcentrifugadora durante a noite a 4 ° C. Coloque a pelota em um molde de base e incorporar adicionando médio de temperatura (OCT) corte ideal sobre gelo seco. 5-10 µm seções em um cryotome de corte e proceder com imunofluorescência/imunohistoquímica ou padrão histológicas manchas. Para isolamento da proteína Adicione 150 µ l de tampão RIPA a pelota glomerular centrifugada com 1,5 µ l de inibidor de protease e homogenizacao com Homogeneizadores de tecido. Proceda à quantificação de proteína e immunoblotting ou outras análises de proteína.