Caracterización funcional de carboxilesterasas en casa resistente al insecticida moscas, Musca Domestica

Resistencia a los insecticidas es actualmente un grave problema de casa control de moscas en todo el mundo^1,2. Esfuerzos para determinar el mecanismo de resistencia a los insecticidas facilita la mejor comprensión de este tema y así proporcionar nuevas estrategias para efectivamente prevenir o minimizar la propagación de resistencia desarrollo³. Carboxilesterasas, como una de las enzimas de desintoxicación más importantes, han atraído mucho la atención por su participación en el secuestro y metabolizan insecticidas en varios insectos^4,5,6. Nuestro estudio anterior ha identificado múltiples carboxilesterasas en casa vuelan y sus niveles de expresión no sólo fueron constitutivamente para arriba-regulados en la cepa ALHF resistente pero también pueden ser inducido a mayores niveles en respuesta a los tratamientos de permetrina⁷ . Sin embargo, la caracterización funcional de estos genes carboxilesterasa en metabolizan insecticidas aún explorarse.

Desde el primer informe de principios de la década de 1980⁸, un sistema de expresión de baculovirus-mediada gen extranjero ha sido empleado ampliamente debido a su eficiencia de producción de alto valor proteico y proteína eucariota procesamiento capacidades⁹. Este sistema binario se compone de dos elementos esenciales: el baculovirus recombinante construcción entrega de genes foráneos en las células del huésped y la expresión a gran escala de proteínas interesadas por las células infectadas por el baculovirus recombinante. En las últimas décadas, el sistema de expresión de baculovirus mediada por células ha sido ampliamente utilizado para producir miles de proteínas recombinantes, que van desde enzimas citosólicas a las proteínas de membrana-limitan en insectos y mamíferos las células¹⁰. Nuestro estudio anterior ha expresado con éxito múltiples enzimas CYP450 en insectos células Sf9 con este sistema¹¹. En este estudio, construido un baculovirus recombinante carboxilesterasa para infectar insectos células Sf9, exploró la tolerancia celular a permetrina diferentes tratamientos y a gran escala carboxilesterasa expresa proteínas en vitro para funcional exploración. En lugar de investigar múltiples mezclas de isoenzima carboxilesterasa de insectos homogenados adoptados por anteriores estudios^12,13, este sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada permite la expresión concreta y aislamiento de proteínas específicas para la mejor caracterización de sus propiedades bioquímicas y estructurales.

El ensayo basado en la sal de tetrazolio (MTT) es un método colorimétrico de alto rendimiento desarrollado y optimizado para medir la viabilidad de las células. Este ensayo se basa en el mecanismo que sólo las células vivas son capaces de metabolizar el reactivo MTT de color amarillo a un precipitado precipitado de color púrpura oscuro, que puede ser analizado por después de disuelto en solventes orgánicos^{14, 15}. Varios más preciso pero requiere mucho tiempo métodos, como la exclusión azul de tripano y la timidina titulación ensayo^16,17, se han desarrollado en los últimos años. Sin embargo, el ensayo MTT celular aún en la actualidad es reconocido como el método más rápido y fácil manejo para detectar rápidamente la viabilidad celular. Aquí, utilizamos el ensayo MTT para explorar la tolerancia de la célula contra los tratamientos insecticidas. La mayor tolerancia de las células cuando infectadas con baculovirus recombinante carboxilesterasa fuertemente apoya las funciones metabólicas de carboxilesterasas a los insecticidas, que a su vez, sugiere su participación en la resistencia a los insecticidas.

Además, un ensayo en vitro metabólica también se realizó en este estudio. En comparación con ensayos de carboxilesterasa general que utilizan sustratos comunes tales como acetato de α-napthyl (α-NA) y β-naftil acetato (β-NA) para reflejar actividades hidrolíticas de carboxilesterasas, estudio metabólico en vitro es considerado como una forma precisa medir directamente actividades de carboxilesterasas hacia insecticidas¹⁸. Este método se ha empleado con éxito en varios insectos para caracterizar varios cytochrome P450s en asociación con insecticida resistencia^11,19,20. Sin embargo, este método ha no aún ha aplicado en estudios de la carboxilesterasa. Con la disponibilidad de la carboxilesterasa proteínas producidas por el sistema de expresión de baculovirus-mediada, podemos realizar un estudio metabólico en vitro de carboxilesterasas hacia permetrina, que puede proporcionar más fuerte evidencia de la participación de carboxilesterasas en confiriendo resistencia a piretroides en casa vuela.