Caratterizzazione funzionale di Carboxylesterases in casa resistente all'insetticida mosche, Musca Domestica

Resistenza agli insetticidi è attualmente un problema importante di casa controllo della Mosca in tutto il mondo^1,2. Gli sforzi per determinare il meccanismo della resistenza agli insetticidi facilita la comprensione di questo problema e quindi fornire nuove strategie per efficacemente prevenire o ridurre al minimo la diffusione di resistenza sviluppo³. Carboxylesterases, come uno degli enzimi più importanti di disintossicazione, hanno attirato molta attenzione per i loro ruoli in sequestranti e metabolizzare gli insetticidi in vari insetti^4,5,6. Il nostro studio precedente ha identificato più carboxylesterases in casa mosche e loro livelli di espressione non erano solo costitutivamente up-regolato nel ceppo resistente ALHF ma possono anche essere indotta a più alti livelli in risposta ai trattamenti di permetrina⁷ . Tuttavia, le caratterizzazioni funzionali di questi geni carbossilesterasi nel metabolismo insetticidi rimangono per essere esplorato.

Dal primo rapporto nei primi anni 1980⁸, un sistema di espressione di baculovirus-mediata del gene straniero è stato ampiamente impiegato grazie alla sua efficienza di produzione ad alta percentuale proteica e la proteina eucariotica elaborazione capacità⁹. Questo sistema binario è composto da due elementi essenziali: il baculovirus ricombinanti costruito offrendo geni estranei in cellule dell’ospite e l’espressione su larga scala di proteine interessate da cellule infettate da baculovirus ricombinanti. Negli ultimi decenni, il sistema di espressione di baculovirus mediata delle cellule è stato ampiamente utilizzato per produrre migliaia di proteine ricombinanti, che vanno da enzimi citosolici alle proteine di membrana-limitano in insetto e cellule di mammifero¹⁰. Il nostro studio precedente ha correttamente espresso più enzimi CYP450 in cellule di insetto Sf9 con questo sistema¹¹. In questo studio, abbiamo costruito un baculovirus carbossilesterasi-ricombinante per infettare cellule di insetto Sf9, esplorato la tolleranza delle cellule a permetrina diversi trattamenti e su larga scala carbossilesterasi espresse proteine in vitro per funzionale esplorazione. Invece di indagare più miscele di isozima carbossilesterasi da insetto omogeneati adottata dal precedente studi^12,13, questo sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto permette l’espressione specifica e isolamento di proteine mirati per la migliore caratterizzazione delle loro proprietà biochimiche e strutturali.

Base di sale tetrazolio (MTT) è un metodo colorimetrico di alto-rendimento sviluppato e ottimizzato per misurare la vitalità cellulare. Questa analisi è basata sul meccanismo che solo le cellule viventi sono in grado di metabolizzare il reagente MTT di colore giallo di un precipitato di formazan colorato viola scuro, che può essere analizzato colorimetricamente dopo dissolto in solventi organici^{14, 15}. Molti più accurata, ma metodi che richiede tempo, come esclusione in Trypan blue e la timidina titolazione dosaggio^16,17, sono stati sviluppati negli ultimi anni. Tuttavia, l’analisi di MTT basati su cellule è ancora attualmente riconosciuto come il metodo più rapido e facilmente azionabile per rilevare rapidamente la vitalità cellulare. Qui, usiamo l’analisi di MTT per esplorare la tolleranza delle cellule contro trattamenti insetticidi. La maggiore tolleranza delle cellule quando infettati con baculovirus ricombinanti carbossilesterasi fortemente supporta i ruoli metabolici di carboxylesterases agli insetticidi, che a sua volta suggerisce loro coinvolgimento nella resistenza agli insetticidi.

Inoltre, un’analisi metabolica in vitro è stata anche condotta in questo studio. Rispetto generale carbossilesterasi saggi che utilizzano substrati comuni come acetato di α-napthyl (α-NA) e β-naftil acetato (β-NA) per riflettere l’attività idrolitica di carboxylesterases, lo studio metabolico in vitro è considerato come un modo accurato misurare direttamente attività di carboxylesterases verso insetticidi¹⁸. Questo metodo è stato impiegato con successo in vari insetti per caratterizzare più citocromo P450s in associazione con insetticida resistenza^11,19,20. Tuttavia, questo metodo non è stato ancora applicato negli studi carbossilesterasi. Con la disponibilità di carbossilesterasi proteine prodotte dal sistema di espressione di baculovirus-mediata, possiamo eseguire uno studio metabolico in vitro di carboxylesterases verso permetrina, in grado di fornire ulteriore forte evidenza del coinvolgimento di carboxylesterases nel conferire resistenza piretroide in casa mosche.