人工内耳手術と c57bl/6 マウスに電気的誘発脳幹の応答録音

すべてのプロシージャは、スイス ・ バーゼル大学、動物のケアとガイドラインに従って行われました。彼らはバーゼル、スイスのカントンの獣医のオフィスでライセンスを取得しました。 注:C57bl/6 アダルト マウス、8-12 週間 (重量 20-30 g)、高齢者は、この研究で使用されました。左の耳は、実験の耳として使用されます。右耳内動物コントロールとして機能し、外科的変更はないです。 1. 術前の手順 ケタミン ・ キシラジン (80 mg/kg ケタミン、16 mg/kg キシラジン、i. p.、10 μ L/g の体重で注入されたボリューム) の腹腔 (i. p.) 注入手術の前に動物の 30 分を anaesthetize します。 肯定的なペダルと眼瞼の (つま先ピンチ) 反射と低用量ケタミン (45 mg/kg、10 μ L/g の体重で注入された i. p.) ので、ひげの動きによって判断されるように、必要に応じて麻酔を補足します。制度のガイドラインあたりエージェントや線量の政権を置き換えることができます。注: 一般に、動物必要があります注入この政権でエージェントと線量 45-60 分毎。注入電極周り閉鎖する初期の切開から平均時間は、通常 1 〜 1.5 時間です。 通常の呼吸率とつま先ピンチ反射の欠如によって特徴づけられる動物の完全鎮静をチェックします。このレベルの麻酔を維持します。 閉ループの加熱パッドで 36.6 ° c 動物の体の温度を維持します。角膜の脱水症状を避けるために眼軟膏を適用します。これはまた記録にノイズを加えることができる動物の瞬目反射を抑制します。 皮下注射 (皮下) ブピバカイン/リドカインで局所麻酔薬を管理 (0.1 mg/mL ブピバカインと 0.4 mg/mL リドカイン、0.1 mL を皮下投与) 任意の外科的不快感を最小限に抑える目的切開線に沿って。制度のガイドラインあたりエージェントや線量の政権を置き換えることができます。 ムスカリン拮抗薬アトロピンを管理 (アミノ atropinesulfate、0.1 mg/mL、20 μ L 投与 sc は、PBS に溶解) 首の粘液の分泌を減らすために、呼吸を容易にします。制度のガイドラインあたりエージェントや線量の政権を置き換えることができます。 2. 事前耳をつんざく音聴性脳幹反応 (自動) 注:として聞く耳をつんざくよう前後の状態の測定に使用します。左の耳と防音シールド電気ブースで、テストが実行されます。テストし、右利きの人の左耳を後でインプラントをお勧めします。マウスにおける ABR の詳細については、13,14で見つけることができます。タッカー ・ デイヴィス技術 (TDT) ハードウェアとソフトウェア (BioSig)、ABR を記録する使用が、他のシステムを使用することができます。 同側 (左) 耳から ABR の応答を分離する音響泡と反対側 (右) 耳をブロックします。1 mL 注射器、泡を置くし、泡で全体の耳をカバーするマウスの右耳に挿入 (0.1 – 0.2 mL 泡の)。確認注射器シール密接に耳に外耳道に泡を取得するようにします。 左の耳から 10 cm スピーカーを配置します。注:このセットアップのためのスピーカーは、refefence15で述べるように PCB のマイクを使って校正されました。 70% エタノール溶液による ABR の電極をきれいに。皮膚の下に電極を配置: アクティブ (Ch1) 頂点に同側耳の耳介の下 (-) を参照し、後ろ足 (図 1) の地します。 頭の段階とプリアンプを光ファイバー ポート経由で聴覚のプロセッサに接続します。 アクティブのインピー ダンスと参照電極を確認してください。 インピー ダンスが 3 ω 以上の場合は、それらを再配列し、再測定を取りなさい。電極が同じインピー ダンスをしたら、最高の録音が得られます。防音ブースを閉じます。 クリック刺激を提示し、複雑な聴覚プロセッサとソフトウェアの無料のフィールド条件で ABR を記録します。ソフトウェアでクリックして刺激の標準化: 0.1 ms シングル チャネルの単相性クリック 21 Hz で表示されます10 dB ステップ; 10 dB SPL に 90 dB SPL のレベル低下をクリックします。10 ms のウィンドウを記録します。各 dB レベルで 512 応答の合計の平均です。 カスタムメイドの Matlab スクリプトを使用して録音のノイズを低減する 2,000 Hz のローパス フィルターとオフライン 300 Hz ハイパス フィルターを適用します。 認識可能な ABR 波応答 (図 2図 3) で最下位の dB レベルとして ABR 閾値を決定します。 3. 手術 注:使用される典型的な器械には、ハサミ、メス、直線または曲線のヒント、組織リトラクター ツールといくつかの吸引ウェッジ、吸収紙ポイント金属鉗子のペアが含まれます。左の耳は手術します。 右側にマウスを置きます。頚椎の過度のねじり応力を避けるため。気道を開いたままに体をまっすぐにすることを確認します。 ハサミで左耳の後ろに毛皮をカット (または、シェーバーで剃る) 肌を露出します。70% エタノール溶液と betadine (ポビドン ・ ヨード) 皮膚を消毒します。 顕微鏡倍率 (16 x)、[1-1.5 cm 後耳介切開メスとを確認します。 高い顕微鏡倍率 (25 x) に切り替えます。 鉗子で皮下の脂肪層の厚さが可変することができますを通じて鈍的切離を実行します。注:切り裂く、外頸静脈がこの地域を通過する場合は注意してください。この構造体への損傷は、過度の出血を引き起こす可能性が。 鼓室胞骨膜を明らかにする胸鎖乳突筋を撤回します。キー解剖学的ランドマークとして顔面神経を聴覚ブラの識別を支援するために使用します。顔面神経は、胸鎖乳突筋の後方/背側のエッジの周りをラップし、吻方に向かって耳介外耳道に沿って実行されます。そっとブラ (図 4) へのアクセスを容易にするため切開で自己保持のリトラクター ツールを置きます。 ブラと乳様突起の間の尾根の明確に可視化できるようにブラのメディオ背側領域を覆う組織を削除します。 そっとブラをピアスと穴を開けて (bullostomy) (骨がこちら側に薄く) リッジの後上側に 30 G の針を回転させます。また、歯科用の手術用ドリルを使用します。注:好ましい場合に、さらに高い顕微鏡倍率 (40 倍) でしてこの手順と次の手順を行うことができます。また、必要に応じて顕微鏡の位置を変更します。中間耳領域の手術のビューを最大化することが重要です。 細かい先端の鉗子を使用して中耳腔を公開する小さな骨の部分をつまんで、bullostomy を広げます。丸い窓のニッチが骨を覆うまでは、背側突起に向かって bullostomy を拡張します。アブミ骨動脈、内頚動脈の枝は、丸い窓のニッチに腹側を実行されます。 致命的になるかもしれない過度の出血、血管を損傷しないように注意します。小出血は、内耳腔 spongostan の小片を押すことで停止できます。 アブミ骨、楕円形の窓に接続して中耳の骨を視覚化する前方方向に bullostomy を拡張します。 楕円形の窓を公開する鉗子であぶみ骨を削除します。 4 耳毒性のエージェントのラウンドのウィンドウ アプリケーション 優しく鈍化 30 G 針を使用して円形のウィンドウと楕円形の窓の膜を穿孔します。その外リンパが実行されるを確認します。 ゆっくりと楕円形の窓によって PBS (pH 7.4 に調整) に溶解した 0.05% 重量/体積ネオマイシンを灌流します。液体を丸い窓からフラッシュする必要があります。丸い窓に同じ手順を繰り返します。灌流に使用する針とウィンドウの骨構造を損傷しないように注意します。 円形のウィンドウと楕円形の窓のニッチ内のネオマイシンに浸した spongostan の小片 (1 mm2) を配置します。 リトラクター ツールを削除、切開を閉じるし、30 分を待ちます。 5. 後つんざくよう音響 ABR (手順 2.2 2.8) 耳をつんざく前とに、同様の方法で自動を記録 (図 2 b図 3)。 6. CI 電極配列の挿入 注:Intracochlear 電極は、プラチナ/異色症パリレン絶縁ワイヤ シールド シリコン チューブ (図 5) と 4 つのプラチナ バンド (Ø0.2 mm) で構成されます。 ブラに再度アクセスする切開にリトラクター ツールを配置します。 丸窓 (スカラー座索) の深さで 4回プラチナ リングは丸い窓のすぐ内側のどこに電極配列を挿入します。これは16〜 30 kHz で intracochlear 位置に対応する、〜 2 mm の挿入深さを与えます。 ブラの中のリード線をコイル、ブラの上の組織にワイヤーを接着します。実験全体の場所に配列を維持するのに役立ちます、ワイヤを巻き付けます。 慎重に、リトラクターを削除し、組織接着剤で挿入を閉じます。 どこの間の線に垂直な首の小切開 (0.5 mm) をするアクティブな参照 ABR 電極、組織シザーを使用します。皮下ポケット内プラチナ地面と球を置き、組織接着剤 (図 6) で小切開を閉じる。 電極アレイ基板を動物の刺激プラットフォームに接続します。 7. 電気聴性脳幹反応 (チャンネル接触型マイクロ) 注:動物の刺激プラットフォーム (ASP) は、電極アレイの電気刺激に使用されます。他の電流源とソフトウェアのシステムを使用できます。 ABR として前に電極 (ステップ 2.3 〜 2.5) (図 6) を配置します。 ASP ソフトウェアを開き、電気パルス刺激パラダイムを定義します。50 μ s/相電荷平衡二相パルスを使用し、中間期の 10 μ s ギャップ 23.3 パルス/秒 (pps) で発表されました。電気刺激は、モノポーラ電極構成では現在のレベルを増加すると配信されます。400 応答の合計を平均して、それぞれの現在のレベルで。 電気パルスを提示し、TDT パッチアンプ用アダプターを介して継続的に誘発チャンネル接触型マイクロ応答、前置増幅器および聴覚のプロセッサを記録します。 プロットし、カスタムメイドの matlab スクリプト (図 7) を介してチャンネル接触型マイクロ データを分析します。スクリプトと録音の例は施行で提供されます。 8. 実験の終わり 実験の終わりには、制度のガイドラインによると動物を安楽死させます。 慎重に切開部を開き、インプラントを削除します。 ティッシュの残骸を削除する 10 分間蒸留水で電極アレイをウルトラ超音波します。注:インプラント電極が正常で、正しく行う場合に複数回再利用できます。これを確認するには、配列が乾燥しているマルチメータと電極のインピー ダンスを測定します。 乾燥した場所で電極の配列を格納します。