概要

Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone mit Bioassay-geführte Fraktionierung

Published: July 17, 2018
doi:

概要

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu isolieren und zu charakterisieren, Struktur, olfaktorische Potenz und Verhaltensreaktion des vermeintlichen Pheromon Verbindungen der Meer Neunaugen.

Abstract

Bioassay-geführte Fraktionierung ist eine iterative Vorgehensweise, die die Ergebnisse der physiologischen und verhaltensbezogenen Bioassays verwendet, um die Isolierung und Identifizierung von einer aktiven Pheromon-Verbindung führen. Diese Methode führte in der erfolgreichen Charakterisierung der chemischen Signale dieser Funktion als Pheromone in einer Vielzahl von Tierarten. Meer Neunaugen setzen auf Geruchssinn, Pheromone zu erkennen, die Verhaltens- oder physiologische Reaktionen zu vermitteln. Wir nutzen dieses Wissen der Biologie der Fische, um Funktionen des vermeintlichen Pheromone zu postulieren und die Isolierung und Identifizierung von aktiven Pheromon-Komponenten führen. Chromatographie wird verwendet, um zu extrahieren, zu konzentrieren und Verbindungen aus dem konditionierten Wasser zu trennen. Elektro-Olfactogram (EOG) Aufnahmen werden durchgeführt, um festzustellen, welche Fraktionen olfaktorische Reaktionen hervorrufen. Zwei-Wahl Labyrinth Verhaltens Assays werden dann verwendet, um festzustellen, ob die duftenden Fraktionen auch verhaltensorientierte aktiv sind und eine Präferenz induzieren. Spektrometrische und spektroskopische Methoden bieten das Molekulargewicht und strukturelle Informationen gerne bei der Strukturaufklärung. Die Bioaktivität der reinen Verbindungen wird mit EOG und Verhaltensstörungen Assays bestätigt. Die Verhaltensreaktionen beobachtet im Labyrinth müssen letztlich in eine Feld-Einstellung, um ihre Funktion in einem natürlichen Bach Einstellung bestätigen überprüft werden. Diese Bioassays eine doppelte Rolle um 1) führen die Fraktionierung Prozess und (2) bestätigen und weiter zu definieren, die Bioaktivität der isolierte Komponenten. Hier berichten wir über die repräsentativen Ergebnisse einer Meerneunauge Pheromon-Identifikation, die exemplarisch für das Dienstprogramm des Bioassay-geführte Fraktionierung Ansatzes. Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone ist besonders wichtig, weil eine Modulation der Pheromon-Kommunikations-System unter den Optionen als invasive Meerneunauge im Laurentian Great Lakes zu kontrollieren ist. Diese Methode kann leicht angepasst werden der chemische Kommunikation in einer breiten Palette von Taxa zu charakterisieren und werfen Licht auf Wasserbasis Chemische Ökologie.

Introduction

Pheromone sind spezielle chemische Signale, die von Personen, die ihnen Hilfe bei der Ortung Nahrungsquellen, Erkennung von Raubtieren und Vermittlung von sozialen Interaktionen der Artgenossen1veröffentlicht. Pheromon-Kommunikation bei Insekten wurde gut untersuchte2; die chemische Identifizierung und biologische Funktion der aquatischen Wirbeltieren Pheromone haben jedoch nicht so umfassend untersucht worden. Die Identität und Funktion der Pheromone freigegeben können angewendet werden, um die Wiederherstellung der bedrohten Arten3,4 oder Kontrolle Schädling Arten5,6zu erleichtern. Die Anwendung dieser Techniken erfordern die Isolierung und Charakterisierung von bioaktiven Pheromon-Komponenten.

Pheromon-Identifikation ist ein Zweig der Naturstoffchemie. Fortschritte in der Pheromon-Forschung wurde aufgrund der Beschaffenheit der Pheromon-Moleküle sich teilweise begrenzt. Pheromone sind oft instabil und in kleinen Mengen freigegeben, und nur ein paar Sampling-Techniken existieren, um winzige Mengen von flüchtigen7,8 oder wasserlöslichen Verbindungen9zu erkennen. Ansätze, Pheromone zu identifizieren sind (1) eine gezielte Überprüfung der bekannten Verbindungen, Metabolomik (2) und (3) Bioassay-geführte Fraktionierung. Eine gezielte Überprüfung der bekannten Verbindungen testet im Handel erhältlichen metabolische Nebenprodukte der physiologischen Prozesse, die die Hypothese als Pheromone funktionieren. Dieser Ansatz begrenzt, weil Forscher nur bekannte und verfügbare Verbindungen testen können. Allerdings hat es die erfolgreiche Identifikation von Sexualhormonen in Goldfisch diese Funktion als Pheromone10,11,12geführt. Metabolomik ist ein zweiter Pheromon-Identifikation-Ansatz, der potenzielle niedermolekulare Stoffwechselprodukte innerhalb eines biologischen Systems13unterscheidet. Ein Vergleich der Stoffwechselprofile von zwei Gruppen (d. h., eine aktive im Vergleich zu inaktiven Auszug) ermöglicht die Identifizierung eines möglichen metabolischen Profils aus, der Metabolit gereinigt wird, ist die Struktur aufgeklärt, und die Bioaktivität ist bestätigten14. Additive oder synergistische Wirkungen der komplexen Formulierungen bestimmte Mischungen sind eher mit Metabolomics erkannt werden, weil Metaboliten zusammen anstatt als eine Reihe von Fraktionen13gelten. Doch hängt die Umsetzung der Metabolomik die Verfügbarkeit von synthetischen Referenzen weil die resultierenden Daten nicht die Aufklärung der neuartige Strukturen erleichtern.

Bioassay-geführte Fraktionierung ist ein integrierte, iterativen Ansatz, die zwei Felder umfasst: Chemie und Biologie. Dieser Ansatz nutzt die Ergebnisse der physiologischen und verhaltensbezogenen Bioassays, die Isolierung und Identifizierung von einer aktiven Pheromon-Verbindung führen. Ein grober Extrakt ist fraktioniert durch eine chemische Eigenschaft (d.h., Molekülgröße, Polarität, etc.) und getestet mit Elektro-Olfactogram (EOG) Aufnahmen und/oder in einem Bioassay. Die bioaktiven Komponenten werden heraus durch Wiederholen Sie diese Schritte der Fraktionierung und EOGs bzw. Bioassays gezeigt. Die Strukturen der reinen Wirkstoffe sind durch spektrometrische und spektroskopische Methoden aufgeklärt, die das Molekulargewicht und Strukturinformationen herstellen eine Vorlage der Verbindung synthetisiert werden. Bioassay-geführte Fraktionierung kann nachgeben, diverse Metaboliten und potenziell neuartige Pheromone mit einzigartigen chemischen Skelette, die wahrscheinlich nicht von den biosynthetischen Bahnen vorhergesagt werden.

Hier beschreiben wir die Bioassay-geführte Fraktionierung Protokoll zu isolieren und zu charakterisieren die Bioaktivität der männlichen Meerneunauge Sex Pheromon Verbindungen verwendet. Meerneunauge (Petromyzon Marinus) ist ein ideales vertebrate Modell Pheromon Kommunikation zu studieren, weil diese Fische verlassen sich stark auf die olfaktorische Detektion von chemischen Signale zu vermitteln ihre anadrome Lebensgeschichte, bestehend aus drei Phasen: Larven, Jugendliche und Erwachsene. Meerneunauge Larven bohren sich in das Sediment von Süßwasser-Streams, eine drastische Metamorphose zu unterziehen, und Jugendliche, die an einem See oder Meer, wo sie große Host Fische parasitieren, migrieren verwandeln. Nach dem ablösen von der Host-Fisch, migrieren die Erwachsenen wieder Laich Bäche, geleitet von den wandernden Pheromone freigegeben durch Stream-Resident Larven15,16,17,18,19 . Reife Männer zu den Laichgründen aufsteigen, lassen Sie ein Mehrkomponenten Sex Pheromone um Freunde zu gewinnen, zeitweise Laichen für etwa eine Woche und dann sterben15,20. Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone ist wichtig, weil eine Modulation der Pheromon-Kommunikations-System unter den Optionen als die invasiven Meer Neunaugen in der Laurentian Great Lakes21zu kontrollieren ist.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 und 02/17-031-00) genehmigt. 1. Erfassung und Gewinnung von Meerneunauge bedingt Wasser Ort geschlechtsreif männliche Meer Neunaugen (15-30 Tiere) in einem Tank geliefert mit 250 L kohlensäurehaltiges Lake Huron Wasser gepflegt bei 16-18 ° C. Sammeln Sie die männlich konditioniertes Wasser in jeder Nacht von Juni bis Juli.<b…

Representative Results

Ein Diagramm einer Zusammenfassung des Protokolls der Bioassay-geführte Fraktionierung beschriebenen Schritte ist in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll erfolgt in Schritten zu isolieren und zu charakterisieren, die Struktur, die olfaktorische Potenz und Verhaltensstörungen Tätigkeitsbereich 5 vermeintliche Meerneunauge Pheromone (Abbildung 2). Mit der Masse spektrometrische und NMR-Daten (Abbildung 3</s…

Discussion

Fische leben in einer chemischen Welt voller Verbindungen noch identifiziert werden. Bioassay-geführte Fraktionierung bewährt wesentlich zu identifizieren und zu charakterisieren, bioaktive Moleküle, die viele chemische Interaktionen, wie bei Masu-Lachs31, Asiatische Elefanten32und Meer Neunaugen33zu vermitteln, 34,35. Bioassay-geführte Fraktionierung ist ein effektives Vorgeh…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken der US geologischen Umfrage Hammond Bay biologische Station für die Nutzung ihrer Forschung Einrichtungen und das Personal der US Fish and Wildlife Service und Fischerei und Ozeane Kanada für die Bereitstellung Meer Neunaugen. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der Great Lakes-Fischerei-Kommission Weiming Li und Ke Li unterstützt.

Materials

Premium standard wall borosilicate capillaries with filament  Warner Instruments G150F-4 recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm)
Pipette puller instrument  Narishige PC-10 pulls electrodes for EOGs
Diamond-tipped glass cutter Generic cut tip of electrodes for EOG
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150-4 odorant delivery tube for EOG
Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm Warner Instruments ESP-M15N recording electrode holder
Reference electrode holder E Series with handle with  Ag/AgCl pellet  for glass capillary OD 1.5 mm Warner Instruments E45P-F15NH reference electrode holder
1 mm pin Warner Instruments WC1-10 to bridge reference and recording electrode holders
2 mm pin Warner Instruments WC2-5 to bridge reference and recording electrode holders
Agar Sigma A1296 molten agar to fill electrodes
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333 3M KCl to fill electrodes and electrode holders
Micropipette microfil World Precision Instruments MF28G-5 to fill electrodes and electrode holders 
L-Arginine Sigma A5006 positive control odorant for EOG
Methanol Sigma 34860
Water bath Custom made N/A holds odorants for EOG
3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) Syndel USA Tricaine1G EOG anesthetic 
Gallamine triethiodide Sigma G8134-5G EOG paralytic
1 mL syringe BD Biosciences 301025 to administer paralytic
Subcutaneous needle 26G 5/8 BD Biosciences 305115 to administer paralytic
Roller clamp World Precision Instruments 14043-20 adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth
Sodium chloride (NaCl) J.T. Baker 3624-05 for preparation of 0.9% saline
V-shaped plastic stand as specimen stage Custom made N/A holds lamprey during EOG
Plastic trough Custom made N/A holds V-shaped plastic stand during EOG
Scalpel Blades – #11 Fine Science Tools 10011-00 for EOG dissection
Scalpel Handle – #3 Fine Science Tools 10003-12 for EOG dissection
Straight ultra fine forceps Fine Science Tools 11252-00 for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps
Curved ultra fine forceps Fine Science Tools 11370-42 for EOG dissection, Moria MC40B
Straight pring Scissors Fine Science Tools 15003-08 for EOG dissection
Stereomicroscope Zeiss Discovery V8 for EOG dissection
Illuminator light Zeiss CL 1500 ECO for EOG dissection
Plastic tubing Generic to connect re-circulating EOG setup and water baths
Odorant delivery tubing  Custom made N/A
In line filter and gasket set Lee Company TCFA1201035A
Micromanipulators Narishige MM-3 to position electrodes and odorant delivery capillary tube
Magnetic holding devices Kanetec MB-K
Valve driver Arduino custom made to control the opening of the valve for odor stimulation
Electromagnetic valve Lee Company LFAA1201618H valve for odor stimulation
NeuroLog AC/DC amplifier Digitimer Ltd. NL106 to increase the amplitude of the elictrical signal
NeuroLog DC pre-amplifier with headstage Digitimer Ltd. NL102G to increase the amplitude of the elictrical signal
Low-pass 60 Hz filter Digitimer Ltd. NL125
Digitizer Molecular Devices LLC Axon Digidata 1440A
Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software Molecular Devices LLC AxoScope version 10.4 
Faraday cage Custom made N/A Electromagnetic noise shielding
Two-choice maze Custom made N/A waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner
Trash pump Honda WT30XK4A fills maze with water from nearby river
Peristaltic pump with tubing Cole Parmer Masterflex 07557-00 to adminster odorants in maze
Inverter Generator  Honda EU1000i powers perstaltic pump
Release cage Custom made N/A used to acclimate lamprey in the maze
Mesh Generic used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers
Buckets (5 gallon) Generic to mix odorants
Flow meter Marsh-McBirney Flo-Mate 2000 to measure discharge
XAD 7 HP resin Dow chemical 37380-43-1 for extraction of conditioned water 
Methanol Sigma 34860 for extraction of conditioned water 
Water bath Yamato BM 200 for extraction of conditioned water 
Freeze dryer Labconco CentriVap  Concentrator for extraction of conditioned water 
chloroform Sigma CX1050 for isolation of fraction pools
Silica gel 70-230 mesh Sigma 112926-00-8 for isolation of fraction pools
Silica gel 230-400 mesh Sigma 112926-00-8 for isolation of fraction pools
Pre-coated silica gel TLC plates Sigma 99571 for isolation of fraction pools
anisaldehyde Sigma A88107 for isolation of fraction pools
Sephadex LH-20 GE Healthcare 17-0090-01 for isolation of fraction pools
Amberlite XAD 7 HP resin Sigma XAD7HP for extraction of conditioned water 
4, 2.5L capacity glass columns Ace Glass Inc. 5820 for extraction of conditioned water 
Acetone Sigma 650501 for extraction of conditioned water 
TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) Waters Co. N/A for structure elucidation
Binary HPLC pump Waters Co. 1525 for isolation of fraction pools/compounds
Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) Agilent N/A for structure elucidation
Rotovap drying system Buchi RII for extraction of conditioned water 
UV lamp (254 nm) Spectronics Co. ENF-240C for thin layer chromatography 

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記事を引用
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