注射器-注射用网状电子技术稳定的慢性啮齿动物电生理学

所有关于脊椎动物的程序都由哈佛大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准。 1. 网格电子的制作 注: 本节描述的程序旨在用于标准的大学洁净室设施, 如哈佛大学纳米系统中心 (CNS)。这一设施以及类似设施可供美国各地的外部用户访问, 例如, 作为国家科学基金会 (NSF) 支持的国家纳米技术基础设施网络 (NNIN) 的一部分。在这些设施中, 本节所述的许多工具、设备和材料都是在进入洁净室设施的同时提供的, 不需要单独购买。 注意: 在制造网格电子学中使用的许多化学物质都是有害的, 包括抵抗、CD-26、卸妆 PG、SU-8 开发人员和镍蚀刻溶液。在使用和实施之前, 请查阅这些化学品的材料安全数据表 (MSDS), 并在任何时候遵守适当的安全措施。 将 100 nm 的镍热蒸发到清洁的硅晶片上。注: 典型沉积参数为 5 x 10-7 T 的基压和Å/s 的速率。薄层的镍作为牺牲层, 稍后将被解散, 以释放网状电子从晶片。 使用第一个 pl 掩模 (pl mask-1), 以 SU-8 负光刻胶 (图 2A) 定义网格电子的底层钝化层。注意: PL 是一种标准微细加工技术, 紫外线 (UV) 光照射在感光基板上的面具上。光要么使不溶性 (阴性抵抗) 或可溶性 (正面抵抗) 暴露的区域在基体上。掩码在计算机辅助设计 (CAD) 软件中绘制, 然后通常从供应商处订购。掩码光刻用于将掩码与基板上的现有图案对齐, 并将其暴露于 UV 光。制造网状电子学需要四种不同的面具 (pl mask-1 通过 pl mask-4)。我们的面具设计是可要求或从资源网站, meshelectronics.org。 自旋涂层 SU-8 2000.5 负光刻胶到硅片上, 在 4000 rpm 大约 SU-8 厚度的 400–500 nm。 软烘烤的硅片上的热板上的1分钟在65°c, 其次是1分钟95°c。 将晶片装入掩模光刻, 以将 SU-8 与底网 SU-8 层对应的 PL mask-1 曝光。暴露在一条 i 线 (365 毫微米波长) 药量 100 mJ/cm2。 后烘烤硅片在热板上1分钟, 在65°c, 其次是1分钟95°c。 将晶片浸入 SU-8 开发者的托盘中。轻轻搅动溶液2分钟, 直到 SU-8 中的网格模式得到充分发展。在异丙醇的托盘中冲洗1分钟, 然后吹干。 硬烤的硅片上的热板在180°c 1 小时。注: SU-8 通常在150摄氏度和250摄氏度以下发展后硬烤。硬烘烤退火在开发过程中可能形成的任何表面裂纹, 并进一步 crosslinks SU-8 以确保机械稳定性。硬烘烤在180°c 为底部 SU-8 层和190°c 为顶 SU-8 层数为网格电子提供好结果。 使用 PL mask-2 定义金属互连和 i/o 垫 (图 2B)。 自旋涂层 LOR3A 到硅片上 4000 rpm, 大约厚度为 300 nm。注: LOR3A 是一种以 polydimethylglutarimide 为基础的抗性, 在随后的金属化过程中速度削弱。 在180摄氏度的热板上烘烤硅片5分钟。 自旋涂层 S1805 正光刻胶在 4000 rpm 大约厚度为 500 nm。 在115摄氏度的热板上烘烤硅片1分钟。 将晶片装入掩模光刻, 以将 S1805 与金属互连和 i/o 垫片对应的 PL mask-2 曝光。暴露在 h 线 (405 毫微米波长) 药量 40 mJ/cm2。 将晶片浸入 CD-26 光刻胶显影盘中。轻轻搅动溶液1分钟, 直到金属互连线模式得到充分发展。在一托盘的去离子水 (DI) 冲洗1分钟, 吹干。 热蒸发3毫微米 Cr 跟随80毫微米的 Au。注: 基压最大为 5 x 10-7 T, 沉积速率为1Å/秒, 通常产生最佳膜质量。 将晶片浸入一台去除 PG 的扁平烧杯中大约3小时, 直到金属完全切下, 将金属仅留在所需的互连和网格电子的 i/o 垫区。用异丙醇冲洗, 吹干。 使用 PL mask-3 来定义 Pt 电极 (图 2C)。 重复步骤1.3.1 通过1.3.4。 将晶片装入掩模光刻, 将 S1805 与铂电极对应的 PL mask-3 暴露出来。暴露在 h 线剂量的 40 mJ/cm2。 将晶片浸入 CD-26 光刻胶显影盘中。轻轻搅动溶液1分钟, 直到铂电极模式得到充分发展。在一托盘中漂洗1分钟, 吹干。 使用电子束蒸发器沉积 3 nm 的 Cr, 其次是 50 nm 的 Pt。注: 典型沉积参数为基压为 5 x 10-7 T, 速率为2Å/秒。 将晶片浸入一只约3小时的卸妆 PG 的扁平烧杯中, 直到金属完全切下, 只在所需的网格电子电极位置留下 Pt。用异丙醇冲洗, 吹干。 使用 PL mask-4 定义 SU-8 负光刻胶 (图 2D) 的网格电子的顶钝化层。 重复步骤1.2.1 通过 1.2.5, 除了暴露与 PL mask-4 对应的顶钝化网层 SU-8。 硬烤的硅片上的热板在190°c 1 小时。注: 此温度比底部 SU-8 (步骤 1.2.6) 的硬烘焙高10摄氏度。这种升高的温度略微重排版底部 SU-8, 导致它与顶部 SU-8 层合并, 从而形成一个单一的、连续的 SU-8 结构。 网格电子现在完成 (图 2E和图 3);溶解镍牺牲层, 将其从硅晶片中释放出来。 用 50 W 的氧等离子体处理晶片1分钟。这种氧化 SU-8 表面, 使其亲水性, 并允许在水溶液中容易悬浮的网格。 在扁平烧杯中, 将盐酸、氯化铁和 DI 的容积率分别为 1:1:20, 以此来解决镍蚀刻。 将晶片浸入镍蚀刻溶液的扁烧杯中大约3小时, 直到网格电子完全从硅晶片中释放。 使用巴斯德吸管将释放的网状电子探针从 Ni 蚀刻转移到100毫升的 DI 烧杯中。将网格电子传送到 DI 的新鲜烧杯中至少3次, 以确保漂洗。 使用巴斯德吸管将网格电子转移到 70%/30% 乙醇/水溶液中进行消毒, 然后使用吸管将网格电子转移到无菌水中冲洗。注: 灭菌后, 网格电子可以转移到其他解决方案, 以功能化。例如, 为了促进细胞黏附, 网状电子可以转移到一个水溶液的聚 d-赖氨酸 (1 毫克/毫升) 为24小时。 使用巴斯德吸管将网状电子探针转移到100毫升的无菌1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)在体内注射之前。 2. 将网格电子装入针头 吸管持有人购买的是开放的流动两端。密封的两端环螺钉紧固件与环氧树脂, 所以在注射过程中没有泄漏 (图 4A)。在继续之前, 让环氧树脂硬化。 将玻璃毛细管针插入吸管支架。使用圆形拧紧螺钉和圆锥垫圈将其固定到位 (图 4B)。本协议采用400µm 内径 (650 µm 外径) 玻璃毛细管针。其他毛细针材料(例如, 金属) 和直径可以使用, 但可能需要改变网格电子学的设计, 以确保可注射性。注: 我们实验室使用了从150µm 到1.17 毫米内径 (250 µm 到1.5 毫米外径) 的毛细管针。通过将横向和纵向 SU-8 网格元素之间的相交角更尖锐, 减小 SU-8 网格元素的宽度, 使用较薄的 SU-8, 使用较粗的 (i. e。较大的单元单元) 网格结构。光掩膜为更小的毛细管针设计的网格是可利用的请求或从资源站点, meshelectronics.org。玻璃毛细管针的内径为400µm 和外径550µm 也可在商业上。这些减少了注射引起的急性组织损伤, 同时保持了与需要400µm 内径的网格的兼容性, 但它们并没有用于此处描述的研究。 使用2–4厘米长的毛细管管, 将1毫升注射器连接到吸管托架的侧出口。 将玻璃毛细管针插入包含网格电子的 PBS 的100毫升烧杯中。将针的末端定位在网格电子探针的 i/o 垫附近, 并手动收回注射器, 以便在针上绘制网状电子探针 (图 5和辅助视频 1)。注: 当网格电子探头悬浮在溶液中时, 用肉眼可以很容易地识别出 i/o 垫片、阀杆互连区域和网格设备区域。这样就可以明确地将网格电子加载到针中, 并且方向正确。 推/拉注射器, 而仍然浸泡在生理盐水, 以调整网格电子在针的位置。注意: 理想定位是与 ultraflexible 网格设备区域尽可能接近针的末端。这种配置最大限度地减少了将注入大脑的液体体积, 同时保证了设备区域首先被注入, 并且 i/o 垫最后。 小心地从吸管持有者的侧出口处分离毛细管管。慢慢地将其分离, 以避免产生能改变针内网状电子位置的吸力。 3. 将网状电子定向到活鼠脑中 注: 小鼠用腹腔注射麻醉, 混合了75毫克/千克氯胺酮和1毫克/千克 dexdomitor。术前采用趾夹法对麻醉程度进行了验证。在麻醉下, 在37摄氏度恒温毯上放置鼠标, 保持体温。为手术实施了适当的不育技术, 包括但不限于热处理所有金属手术器械, 使用前1小时, 使用消毒手套, 使用热珠灭菌器贯穿整个手术, 维持无菌领域在手术现场周围, 用70% 乙醇消毒塑料器械, 脱毛头皮皮肤在切口前用碘伏准备。为生存手术, 在手术结束后, antiobiotic 软膏被应用在伤口周围, 老鼠被送回一个装有37摄氏度加热垫的笼子里。老鼠没有被留在无人看管, 直到他们恢复了足够的意识, 以维持胸骨卧床。在手术后, 小鼠通过腹腔注射0.05 毫克/千克体重每12小时剂量的丁丙诺啡镇痛。小鼠在手术后与其他动物隔绝。通过腹腔注射戊巴比妥的剂量为270毫克/千克体重或通过 transcardial 灌注对小鼠进行安乐死 (见步骤 6.1)。调查人员可以指盖革,等等。30, 科比,等等。31, 和量具,等等。32有关啮齿动物立体定向手术的详细信息。 麻醉鼠标并将其固定在立体定向的框架中。 将眼部润滑剂应用于鼠标的眼睛, 以防止麻醉时的干燥。 使用牙钻和立体定向的框架打开一个开颅手术, 在所需的头骨坐标。打开第二个开颅手术远离注射部位插入不锈钢接地螺钉或电线。 用牙科水泥把一个夹紧的基底固定在头骨上。在基板上切下大约1毫米宽的间隙, 以提高过程后期折叠步骤的可靠性。注意: 一个扁平的柔性电缆 (ZIF) 切割到 “L” 形状工作良好 (图 7A), 虽然许多材料将工作, 只要他们是正确的厚度为32通道零插入力 () 连接器 (设计为0.18 英寸0.05 毫米厚电缆)。 使用直角端钳将吸管支架与含有网状电子的针安装在立体定向架上 (图 4C和图 6A)。 使用大约0.5–1米长的毛细管管, 将吸管支架的侧出口连接到注射器泵中固定的5毫升注射器 (图 6D)。注: 确保毛细管管中没有气泡, 然后再将其连接到吸管架上。气泡可以中断注入过程中的流动, 防止网格电子的平滑、可控交付。 使用立体定向的框架将针的尖端定位在大脑中所需的起始位置。注: 这里使用的网格电子探头设计的记录电极分布在长约2毫米和与第一电极位于约0.5 毫米从网格电子的开始边缘 (左-最边缘在图 3A)。因此, 应选择立体定向的坐标, 使起始位置比感兴趣的脑区深0.5 毫米。在掩模设计过程中, 记录电极的分布和位置可以自由选择, 因此, 当记录电极沿其立体定向注入时, 它们会跨越感兴趣的大脑区域。轨迹。 定位相机 (图 6B), 以显示在玻璃针内的网格电子探头的顶端。一些软件允许用户在屏幕上画一条线来标记网格电子的原始位置。 通过将注射器泵设置为低速并按下启动来启动流量。10毫升/小时是一个典型的起始流速为400µm 内径毛细管针。如果网格电子探头不在针内移动, 则缓慢增加流量。注意: 重要的是要尽量减少注入大脑的液体体积, 因为这会损害注射部位周围的组织。最好的结果是, 注射量少于25µL 每1毫米注入网格长度。理想值小于该体积的一半;在我们的实验室, 我们通常注射10–50µL 每4毫米注入网格长度。 当网格电子探针开始在针内移动时, 用网格电子探针的标记原位置作为参考, 使用立体定位框架以相同的速率收回针。注: 此过程称为视场 (FoV) 注射方法25, 允许精确地将网格电子传送到目标大脑区域, 而不皱或错位。当网状电子探针开始在针内移动时, 流量往往会降低。在我们的实验室中, 经常需要20–30毫升/小时的流量来克服网格和毛细针壁之间的静态摩擦, 但一旦启动注射过程, 速率就会降低到10毫升/小时。流量和注入量通常较小的小直径毛细管针。 继续流动的盐水和缩回针, 直到针已经退出头骨。停止注射器泵的流量。 4. 输入/输出接口 注意: 此时, 网格电子探针已经从大脑中所需的起始点注入, 沿着所选的轨迹。针已被收回, 只是在开颅手术与网状电子互联跨越从大脑到针和 i/o 垫仍然在针 (图 7B)。本节使用印制电路板 (PCB;图 7,图 8) 接口到网格电子探针。PCB 通过绝缘基板将 ZIF 连接器连接到32通道标准放大器接头, 成为神经记录实验的头部阶段。PCB 是可定制的, 以适应各种头部阶段的配置。我们的设计文件可根据要求或资源网站 meshelectronics.org 提供, 可用于从 PCB 制造和组装服务供应商那里廉价购买多氯联苯。 使用立体定向的框架, 仔细引导针, 以使夹紧基板和跨越的差距, 流动的解决方案与注射器泵产生松弛的网状电子互联 (图 7C)。 一旦针在夹紧衬底上并穿过缝隙, 恢复流速以快速速度将网格电子 i/o 垫片弹出到夹紧衬底上 (图 7D)。 使用镊子和 DI 吸管, 将 i/o 垫片弯曲至90°角, 尽可能接近第一个 i/o 垫。注: 弯曲是必要的, 以允许垫在 ZIF 连接器上的 PCB 在随后的步骤。ZIF 连接器与网格电子探头的 32 i/o 垫片的宽度完全相同, 因此, 一个不完美的90°弯曲, 或在第一个 i/o 垫之前没有发生的弯曲, 将导致不得不切断 i/o 垫 (最左边的垫在图 7E)。 一旦 i/o 垫对齐, 展开, 并在一个90°的角度到网格茎, 干燥他们在原地轻轻流动压缩空气。注: 不到32个通道的网格电子探头可以与相同的32通道接口板连接。例如, 我们的实验室通常使用16通道的网状电子探头和32通道的多氯联苯。这在 ZIF 连接器中提供了额外的空间, 使得接口更容易, 并且附加的与世隔绝通道通过在记录会话期间的阻抗测试很容易被识别为开路电路。 从 i/o 垫的边缘将夹紧衬底从大约 0.5–1 mm 的直边切开。还可以切断夹紧衬底的多余部分, 这将阻碍插入 PCB 安装的32通道 ZIF 连接器 (图 7F)。 将 i/o 垫片插入 PCB 上的 ZIF 接头并关闭闩锁 (图 7G)。使用测量电子测量通道和地面螺钉之间的阻抗, 以确认成功的接口。如果阻抗值太高, 松开 ZIF 连接器, 调整插入, 然后重新测试, 直到确认成功的连接。 覆盖 ZIF 连接器和暴露的网状电子互联与牙科水泥保护。在承印物的缝隙上翻转 pcb, 用水泥将 pcb 固定在老鼠头骨上 (图 7H)。注: 弯曲的缺口在间隙减少的机械应变, 有时可以打破网状电子互联。 允许水泥硬化, 使 PCB 成为一个健壮的, 紧凑的头阶段, 以便在随后的记录会话中进行接口 (图 7I)。 5. 神经记录实验 将鼠标放在 tailveiner 或其他抑制剂33中。将前置放大器 pcb 插入头级 pcb 上的标准放大器接头。使用单独的电缆接地参考螺钉。 对于受限制的录制, 请将鼠标放在抑制剂中。使用数据采集系统记录所需时间段内的数据 (图 8A)。 对于自由移动录音, 在插入前置放大器 PCB 和接地参考螺钉后, 从抑制剂中松开鼠标。在鼠标自由行为时使用数据采集系统记录所需的时间长度 (图 8B)。 在录制会话结束时, 如果需要, 将鼠标放回抑制剂。卸下接地线和前置放大器, 然后将鼠标放回其笼子并返回到动物设施, 直到下一次录制会话。 6. 组织学切片、染色和成像 等到所需的时间后注射, 然后麻醉鼠标和 transcardially 灌注与甲醛。将大脑移除、冷冻和 cryosection 10 µm 厚切片。Evilsizor、 et、cryosectioning 的免疫组化和脑组织功能的详细协议。34。注: 含有网状电子的脑组织可以被固定和切片, 即使监控电子设备留在里面。这是一个独特的能力相比, 传统的神经探针, 必须在切片前删除, 因此可以修改组织或使其难以分析探针-组织界面。 在 1x PBS 中冲洗冰冻脑组织切片3次。 在 1x PBS 中, 在0.3% 条海卫 X-100 和5% 山羊血清的溶液中阻断切片。让我们坐在室温下1小时。 用原抗体的溶液孵育切片。这里使用的主要抗体解决方案是兔抗 NeuN (1:200 稀释), 小鼠抗丝 (1:400 稀释), 和鼠抗胶质细胞 (1:500 稀释) 与0.3% 海卫 X-100 和3% 山羊血清。孵化过夜在4摄氏度。 用 1x PBS 冲洗部分9次, 共40分钟。 用二次抗体的溶液孵化大脑部分。在这里使用的二次抗体解决方案是 alexa 氟488山羊抗兔 (1:200 稀释), alexa 氟568山羊抗鼠 (1:200 稀释), 和 Alexa 氟647山羊抗鼠 (1:200 稀释)。在室温下孵育1小时的切片。 用 1x PBS 冲洗部分9次, 共30分钟。 使用 antifade mountant 将玻璃幻灯片上的部分装入盖玻片。在成像前将幻灯片放在黑暗中至少24小时。 用共焦显微镜将 488 nm、561 nm 和 633 nm 激光作为其激发源, 分别为 alexa 氟488、alexa 氟568和 alexa 氟647。利用差分干涉对比 (DIC) 在同一显微镜下对网格电子学进行图像和分析后叠加。