Analyse des N- glycans de Raphanus sativus Cultivars à l’aide de PNGase H⁺

N– glycanes chez les plantes ont attiré l’attention accrue ces dernières années, que des recherches antérieures a souligné N– glycans comme une source potentielle des réactions immunologiques croisées qui peut provoquer des réactions allergiques^1,2 . Il a été démontré précédemment que N– glycans sur les glycoprotéines de la plante peut affecter l’activité catalytique^3,4, thermostabilité et pliage^5,6 ou localisation subcellulaire et ⁷de sécrétion. Afin de corréler les structures glycane avec leurs fonctions respectives, N– glycans doit être sorti des glycoprotéines chimiquement ou par voie enzymatique. La méthode chimique classique pour libérer les deux N– et O– glycanes est β-élimination, dans lequel traitement alcalin échantillon est accompagnée de réduction avec le borohydrure de céder un alditol⁸. Toutefois, cette procédure empêche marquage avec un fluorophore et provoque le carie importante d’unités monosaccharide de l’extrémité réductrice de la structure de glycane. Déglycosylation chimique basée sur le traitement de l’hydroxyde d’ammonium/carbonate est également une méthode alternative couramment utilisés⁹. Aucune de ces méthodes de libération chimique dégrade des protéines intactes, qui permet l’analyse par spectrométrie de masse de glycane non-marqué piscines sans l’interférence des fragments peptidiques dans la même gamme de masse. Cependant, un inconvénient de ces méthodes est le taux de dégradation accrue de α1, 3-fucosylées N– glycans, une structure commune d’hydrates de carbone trouvé dans plantes¹⁰. Par ailleurs, les méthodes de libération enzymatique à l’aide de peptide :N– glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) sont également largement utilisés. Recombinant PNGase F (à partir de Flavobacterium meningosepticum) est le choix le plus courant et permet la libération de tous les types de N– glycanes, sauf les structures portant un noyau α1, 3 fucose^11,12. Par conséquent, PNGase A (isolés des graines d’amandes) est habituellement utilisé pour l’analyse des plantes N– glycans¹³. Toutefois, cette enzyme deglycosylates seulement clivage protéolytique dérivé de glycopeptides et est incapable de déglycosyler natif de glycoprotéines¹⁴. Par conséquent, un bilan de plusieurs étapes échantillon est nécessaire avant analyse plus approfondie, ce qui provoque une perte importante de glycanes, en particulier ceux de faible abondance,¹⁵. L’objectif global de la méthode est de présenter un flux de travail optimisé pour la libération de N– glycanes et fluorescence d’étiquetage de manière simple et robuste. Le raisonnement sous-jacent est que PNGase H⁺, ce qui a été récemment découvert chez Terriglobus roseus et peut être inoculation exprimée chez e. coli, peut hydrolyser N– glycans directement à partir de l’échafaudage de protéines en acides conditions¹⁶. Un avantage clé de l’utilisation de PNGase H⁺ sur des méthodes alternatives, c’est que les réactions de marquage fluorescentes peuvent être effectuées dans le même tube de réaction sans modifier la réaction tampons^17,18. Les conditions de préparation simple et une récupération élevée des oligosaccharides de faible abondance font de cette méthode un outil précieux dans l’analyse des N– glycans. Ce protocole est adapté pour l’analyse des N– glycans de diverses espèces végétales.