概要

Hücre mekanik ile boncuk-Alerjik Optik cımbız Drosophila embriyo sondalama

Published: November 02, 2018
doi:

概要

Biz Optik cımbız hafif levha mikroskop ve hücre mekaniği Drosophila embriyo boncuklar olmadan soruşturma için uygulanması için birleştiğinde bir kurulumu mevcut.

Abstract

Morfogenez genetik desenlendirme ve sağlam hücre ve dokuların şekillendirmek için mekanik kuvvetleri arasındaki koordinasyon gerektirir. Bu nedenle, morfogenetik süreçleri anlamak için bir meydan okuma doğrudan hücresel kuvvetler ve mekanik özellikleri içinde vivo embriyogenez sırasında ölçmek etmektir. Burada, bir Kur Optik cımbız doğrudan kuvvetleri erken Drosophila embriyo hücre-hücre kişiler üzerinde uygulamak için izin verir, bir hafif levha mikroskop birleştiğinde mevcut görüntüleme birkaç kare / saniye hızında iken. Bu teknik genellikle orta sonda üzerinde optik kuvvetleri sarf kullanılan embriyo içine boncuk enjeksiyon gerektirmeyen avantajı vardır. Biz adım adım Kur uygulanması ayrıntı ve deneylerden mekanik bilgi ayıklamak için araçlar önermek. Hücre-hücre kişiler gerçek zamanlı talebiyle izleyerek, bir gerilim ölçümleri gerçekleştirmek ve hücre kişilerinizin Reolojisi araştırmak.

Introduction

Embriyonik gelişim sırasında hücre ve dokulara gelecekteki hayvan şekli deforme son derece tekrarlanabilir bir süreçtir. Bu tür deformasyonlar güçler hücre düzey1,2de etkin nesil gerektirecek şekilde gösterilmiştir. Morfogenetik işlemleri sırasında hücre ve dokuların onların şekli Dönüştür anlamak için o bu nedenle hücreleri ilgili mekanik özelliği değerlendirmek ve doku içinde güçler sırasında işlem3,4 ölçmek için anahtarıdır . Epitel katmanlarda, özellikle Drosophila, yaygın olarak onların yarı-2D geometri nedeniyle ve onların kolayca idare incelenmiştir.

Bir takım teknikler böylece bize ve diğer geliştirme sırasında epitel mekaniği vivo içinde değerlendirmek için tarafından geliştirilmiştir. Biz üç ana teknikleri içinde epitel doku kullanılan hızlı bir bakış verecektir. Yerel mekanik stres hücre kavşak5,6,7,8 veya daha büyük ölçekli9,10,11 ortaya çıkarmak için lazer ablasyon, yaygın olarak kullanılan bir yöntem sağlar hedef mekanik bütünlüğünü bozmaya yerel kesim yaparak. Kesme takip açılış dinamikleri stres önceki ablasyon hem doku12,13Reolojisi bilgi sağlar. İse bir lazer Ablasyon yerel bozulma hücre korteksin gerektirdiği invaziv, dezavantajıdır. Bir doku bütünlüğünün korunması istiyorsa bu nedenle, biri yalnızca ablations sınırlı sayıda yapabilirsiniz. Başka bir dezavantajı açılış hızı genellikle bilinmemektedir viskoz sürtünme üzerinde bağımlı olduğundan ablations sadece gerginlik, hücre kişiler, göreli tahminleri sağlamak olduğunu. Manyetik manipülasyon ayrıca geliştirilmiş ve ferrofluids14 kullanımı ya da ultramagnetic lipozomlar15içeren Drosophilaiçinde kullanılan. Mutlak ölçümler16,17sağlayabilirsiniz, ancak aynı zamanda invaziv Onlar sonda istediğiniz yere, enjeksiyon gerektirir anlamda. Bu her zaman hassas enjeksiyon için müsait değildir sistemine bağlı olarak çok yanıltıcı olabilir. Üçüncü bir teknik, tamamen non-invaziv, kuvvet çıkarım18,19,20‘ dir. Kuvvet çıkarım mekanik (tricellular kavşak veya köşeleri) puan Equilibrium’da varsayımına dayanır ve gerilimler hiç hücre-hücre kişiler (ve muhtemelen, baskılar tüm hücrelerdeki) tarafından ters bir problem çözme tahmin etmesine olanak verir. Gerginlikler için her köşe iki denklemler (X ve Y) sağlar. Bu gerginlik, tüm hücre kişileri değerlendirmek için bazı koşullar altında ters Lineer Denklem büyük bir sistem verir. Sadece kesimli bir görüntü ve hiçbir ilave deney veya kurulum gerektirir gibi bu yöntem çok çekici olmakla birlikte, onun doğruluğunu henüz tespit etmektir ve tekrar sadece sürece bir mutlak kalibrasyon ölçüm gerçekleştirilir göreli değerleri sağlar.

Bazı bu sınırlamalar üstesinden gelmek için biz tanıtmak bu makalede bir Kur Optik cımbız kontrollü güçler Drosophila melanogasterembriyonik epitel hücre ölçeğinde de uygulamak için hafif levha mikroskop için birleştiğinde. Optik cımbız tek protein ve organelleri ve hücreleri21manipülasyon üzerinde ölçümler de dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik uygulamaları için kullanılmaktadır. Burada, küçük bir kaç düzine pN aralığında uygulanan kuvvetler raporu henüz yerel deformasyonlar hücre kişileri ikna etmek ve mekanik ölçümler vivo içindegerçekleştirmek yeterli. Genellikle, hücre kişileri, kymographs, analizi ile izlenen dik sehimi kuvvet deformasyon için ilişkilendirmek için kullanılır. Önemlisi, Optik cımbız doğrudan kuvvetleri hücre-hücre kişiler üzerinde uygulamak için güçlü olduğu gibi bizim ayarlarına boncuk doku, istenen konumda enjeksiyon gerektirmez. Hafif levha mikroskop için Optik cımbız kaplin bir aydınlatma beri çok kayda değer bir mekanik analiz kısa süre ölçekler ve azaltılmış fototoksisite, hızlı görüntüleme (birkaç kare / saniye), gerçekleştirmek izin verir örnek22Imaging uçak için sınırlıdır.

Genel olarak, Optik cımbız bir non-invaziv kontrollü güçler hücre kişiler içinde Drosophila embriyo vivo de uygulamak için ve sertlik ve hücre kişiler23, gerginlik rheological Özellikler gibi mekanik bilgileri ayıklamak için bir yoludur 24ve degrade veya anizotropi gerginlik23.

Protocol

1. ayarlama hafif levha mikroskop Önceki yayın25kurulumunun açıklamasını bakın.Not: Kurulum bir dik mikroskop sahne ve yatay düzlemde hafif bir levha üreten bir hafif levha modülü oluşur. 10 X uyarma objektif lens hafif levha cam küvet (Şekil 4) yönlendirir. Algılama objektif lens verimli (aşağıya bakın) tweezing için gerekli olan yüksek NA (1.1), var. 2. ayarlama Optik cımbız yolu <p class="jov…

Representative Results

Şekil 5 tuzak sinüsoidal bir hareketi koyarak elde edilen deneysel verileri gösterir. Tuzak bir saptırma arabirimin adıyla 3 ardışık arabirimi pozisyonlar (Şekil 5A)23gösterilen 3 anlık görüntüleri tarafından örneği oluşturur. Kaydedilmiş film bir kymograph (Şekil 5B) oluşturmak için kullanılan ve daha fazla her çerçeve için x yön boyunca bir Gauss k…

Discussion

Optik cımbız mutlak mekanik ölçümler doğrudan gelişmekte olan embriyonik epitel içinde non-invaziv bir şekilde gerçekleştirmek için izin verir. Bu anlamda, invaziv ve göreli ölçüler, manyetik kuvvetler, enjeksiyonları gerektiren sağlamak veya güçlü varsayımlara dayanır kesmesi zorla ve aynı zamanda göreceli sağlayan lazer ablasyon gibi diğer yöntemler üzerinde avantajları sunar ölçümleri.

İletişim kuralı birkaç kritik adımları içerir. İlk olarak, objekt…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser bir FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (için s.-Tayback) tarafından desteklenmiştir. Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-10-INBS-04-01, «Yatırımlar gelecek için») tarafından desteklenen Fransa-BioImaging altyapı anıyoruz. Biz Brice Detailleur ve Claude Moretti PICSL-FBI altyapı teknik destek için teşekkür ederiz.

Materials

Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW IPG Laser YLM-10-LP-SC including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser
Ø1/2" Optical Beam Shutter Thorlabs SH05
Small Beam Diameter Galvanometer Systems Thorlabs GVS001 1 for X displacement, 1 for Y displacement
1D or 2D Galvo System Linear Power Supply Thorlabs GPS011 galvanometers power supply
2 lenses f = 30mm Thorlabs LB1757-B relay telescope between 2 galva
Lens f = 200mm Thorlabs LB1945-B 2.5X telescope
Lens f = 500mm Thorlabs LB1869-B 2.5X telescope
Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes Thorlabs KCB1E Periscope
Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style Thorlabs LG1
45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror Edmund Optics #64-470
Multiphoton-Emitter HC 750/S AHF HC 750/SP
CompactDAQ Chassis National Instruments cDAQ-9178
C Series Voltage Output Module National Instruments NI-9263 Analog output module
C Series Voltage Input Module National Instruments NI-9215 Analog input module
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids ThermoFisher Scientific F8812 calibration beads
C++ (Qt) home made optical tweezers software developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview

参考文献

  1. Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
  2. Heisenberg, C. -. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
  3. Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), 186-196 (2016).
  4. Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
  5. Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
  6. Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
  7. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  8. Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
  9. Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  10. Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
  11. Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
  12. Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
  13. Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
  14. Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
  15. Mitrossilis, D., Röper, J. -. C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
  16. Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
  17. Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
  18. Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
  19. Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
  20. Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
  21. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
  22. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  23. Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
  24. Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
  25. Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
  26. Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
  27. Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).

Play Video

記事を引用
Chardès, C., Clement, R., Blanc, O., Lenne, P. Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (141), e57900, doi:10.3791/57900 (2018).

View Video