Prüfende Zelle Mechanik mit Wulst-freie optische Pinzetten in Drosophila Embryos

Embryonalentwicklung ist ein hoch reproduzierbarer Prozess, bei dem die Zellen und Gewebe verformen um das zukünftige Tier zu gestalten. Solche Verformungen haben gezeigt, dass erfordern die aktive Generation der Kräfte an der Zelle Level^1,2. Um morphogenetischen Prozesse zu verstehen, während die Zellen und Gewebe ihre Form zu verändern, ist es daher Schlüssel für die mechanischen Eigenschaften der beteiligten Zellen beurteilen und messen die Kräfte innerhalb des Gewebes während der Prozess^3,4 . Epitheliale Schichten, vor allem in Drosophila, wurden weitgehend durch ihre quasi-2D-Geometrie und ihre einfache Handhabung untersucht.

Eine Reihe von Techniken wurden so von uns und anderen epithelialen Mechanik in Vivo während der Entwicklung zu bewerten. Wir geben einen schnellen Überblick über die drei wichtigsten Techniken in epithelialen Geweben verwendet. Laser-Ablation, eine weit verbreitete Methode erlaubt es, die lokale mechanische Beanspruchung in der Zelle Kreuzungen^5,6,7,8 oder im größeren Maßstab^{9,10,11 zeigen} durch die Durchführung lokaler Kürzungen, die die mechanische Integrität des Ziels zu stören. Die Dynamik der Öffnung nach dem Schnitt informiert der Stress vor Ablation, sowohl auf die Rheologie der Gewebe^12,13. Ein Nachteil der Laser-Ablation ist, dass es invasiv, wie es die lokale Störung des Kortex Zelle erfordert. Daher kann man nur eine begrenzte Anzahl von Ablationen durchführen, will man Gewebe Integrität zu bewahren. Ein weiterer Nachteil ist, dass Ablationen nur relative Schätzungen der Spannung am Zellkontakte, da die Öffnung Geschwindigkeit viskose Reibung abhängig ist, die nicht allgemein bekannt ist. Magnetische Manipulation hat auch entwickelt und in Drosophila, an denen entweder die Verwendung von Ferrofluide¹⁴ oder ultramagnetic Liposomen¹⁵verwendet. Sie bieten absoluten Messungen^16,17, sondern sind auch in dem Sinne, dass sie die Injektion von Sonden an der gewünschten Stelle erfordern invasiv. Dies kann je nach System, sehr schwierig sein die nicht immer präzise Injektionen zugänglich ist. Ein drittes Verfahren, völlig nicht-invasiv, ist Kraft Inferenz^18,19,20. Kraft Ableitung beruht auf der Annahme des mechanischen Gleichgewichts auf dreifache Punkte (Tricellular Kreuzungen oder Scheitelpunkte) und ermöglicht es, Spannungen überhaupt ableiten, Zell-Zell Kontakte (und gegebenenfalls Druck in allen Zellen) durch ein inverses Problem zu lösen. Für Spannungen bietet jeder Vertex zwei Gleichungen (X und Y). Daraus ergibt sich ein großes System von linearen Gleichungen, die unter bestimmten Bedingungen zur Spannung bei allen Zellkontakte Bewertung invertiert werden kann. Während diese Methode sehr attraktiv, da es nur eine segmentierte Bild und keine zusätzliche Experiment oder Setup erfordert, seine Genauigkeit ist noch zu bestimmen, und wieder es bietet nur relative Werte, wenn eine absolute Kalibrierung-Messung durchgeführt wird.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, stellen wir in diesem Artikel eine Setup der optischen Pinzette gekoppelt an ein leichtes Blatt Mikroskop, kontrollierten Kräfte auf der Ebene der Zelle in der embryonalen Epithel von Drosophila Melanogasteranzuwenden. Optische Pinzette wurden für zahlreiche Anwendungen in der Biologie auch die Messungen auf einzelne Proteine und Manipulation von Organellen und Zellen²¹verwendet. Wir berichten hier angewendeten Kräfte im Bereich von ein paar Dutzend pN, die kleine ist noch ausreichend, um lokale Verformungen der Zellkontakte zu induzieren und mechanische Messungen in Vivodurchzuführen. In der Regel verwenden wir senkrecht Auslenkung des Zellkontakte, überwacht durch die Analyse der Kymographs, um Kraft auf Verformung zu beziehen. Wichtig ist, erfordert unser Setup nicht die Injektion von Perlen an der gewünschten Stelle im Gewebe, wie optische Pinzette Kräfte auf Zell-Zell-Kontakte direkt ausüben kann. Die Kopplung der optischen Pinzette zu einem leichten Bogen Mikroskop ermöglicht eine schnelle Bildgebung (mehrere Bilder pro Sekunde), was sehr spürbare für eine mechanische Analyse auf kurzen Zeitskalen und mit reduzierten Phototoxizität, da die Beleuchtung von der Probe ist auf der Ebene von imaging-²²beschränkt.

Insgesamt, optische Pinzette sind eine nicht-invasive Weise kontrollierten Kräfte bei der in-vivo in Drosophila Embryos Zellkontakte anwenden und mechanische Informationsextraktion wie Steifigkeit und Spannung bei Zelle Kontakte²³, rheologischen Eigenschaften ²⁴, und Farbverlauf oder Anisotropie der Spannung²³.