ショウジョウバエ蛹内炎症性細胞動態の長期的な体内の追跡

このプロトコルは 4 つの主要な一連のステップで構成されています:ショウジョウバエ株とショウジョウバエ蛹のステージング、(2) 蛹郭清と取り付けの準備 (1)、(3) 蛹が負傷した、(4)体内タイムラプス顕微鏡を用いたイメージング。 1.ショウジョウバエ株や蛹のステージングの準備 適切なショウジョウバエ株 (導入および材料の表を参照) を取得します。 適切な遺伝子型の若い健康な成虫を収集します。 [大人飛ぶハエを簡単に麻酔する二酸化炭素ガスのパッドを使用して、コレクション バイアルに適切な遺伝子型や性別の転送に罰金絵筆を飛ぶ。 標準的なはえの食糧媒体を含む各バイアルに 20 の処女の女性と 20 男性を追加 (コーンミール糖蜜寒天混合材料の表を参照してください) 酵母を添加しました。 最適な蛹世代チップ大人のハエ毎日新鮮なバイアルは、25 ° C ですべてのバイアルを維持する新しい食品に注: 系統特異的遺伝子発現を駆動する Gal4 UAS システム31を使用している場合の手順をすべて行わなければならない 25 ° c 以上、Gal4 UAS システムは温度に敏感。 スケジュールされたイメージング セッションの前に 18 h バイアル瓶 (すなわち蛹殻形成過程、APF 後 0 h) から少なくとも 10 新しく形成された白い前蛹 (図 1 a) を選択してインテリア バイアル表面から蛹を取り除くため鉗子または罰金エフェクトペイント ブラシ ツールを使用して、きれいな空のプラスチック瓶の側面に蛹を慎重に転送します。注: 放浪 3rd幼虫クロール上向き蛹; を受ける食品媒体から新しく形成された白い前蛹は、すぼまり前気門を所有している (3rd幼虫) とは異なり、静止するいると簡単に識別されます。キューティクルは、’蛹殻’ (蛹の場合) 最初ソフトと白の17であるに変換します。不要な損傷による炎症反応だけでなく重要な発達の遅れにもつながるよう、蛹の損傷を避けるために注意する必要があります。 25 ° C でバイアル (APF は最適な結果を与える 18 h) 適切な発達段階に選択した蛹を時代します。注: 蛹を開発、蛹のケースになります徐々 に暗くより脆性。 その他の試薬を早めに次のステップに備えます。接着剤、重ね両面テープの全長 20 cm を組み合わせて 50 mL 遠心管中 20 mL ヘプタン ヘプタンをするためには、パラフィン フィルムとベンチに一晩室温でロックとシールします。 2. 準備中とショウジョウバエ蛹の解剖 段階的なショウジョウバエ蛹をスライド ガラスにマウントされている両面粘着テープの切れ端に転送します。蛹の位置腹側はテープにしっかりと付着し、背側に上向きに直面している (図 1 b)。注: 前蛹の識別される蛹ケースの前方の端から突き出た 2 つの気門から。 その保護囲蛹ケーシングの鉗子、マイクロ剪刀 (図 1 b・ D) を用いた明視野解剖顕微鏡の下でから蛹を慎重に取り外します。 当初は、鉗子 (図 1 b) を用いた蛹殻の前方の領域に切開を行います。蛹、蛹の発育初期ケース内で縮小しているためにはこの分野で蛹の場合、中空と蛹の組織を欠いていることを確認します。 この初期の切開後慎重に涙や蛹の場合は蛹が褐色不透明の脆性筐体 (図 1) から完全に解放されるまで、鉗子または刀 (図 1) を使用して後方に、前方で開いているカットします。注: この段階で蛹は非常に壊れやすい、蛹の表面を刺さないように注意する必要があります。穿刺は明白な体液はすぐに穿刺部位から漏れ出すです。パンク、しかし小さいと蛹を破棄しなければなりません。 ヘプタンの接着剤を使用してガラス底皿に蛹をマウントします。 20 mL のピペット チップを使用すると、ガラス底皿の上の行に事前に用意されたヘプタン接着剤 (セクション 1.6 上記参照) の 10 mL のドロップを配置します。 5 乾燥して接着剤を許可する鉗子 (図 1E) を用いたヘプタン接着剤の上に慎重に解剖の蛹を転送する前に s。 負傷とイメージングの容易にするため、蛹に並んで行;約 5 蛹が提案されているが、詳細は経験を持つ管理されます。メモ: ヘプタン接着剤の使用は直立したイメージング システムを使用してお勧めしますが逆システムを使用している場合は不要。光学接着剤を作成する場合、coverglass に直接イメージング、蛹の時に収差を代わりに配置できます-蛹の組織とガラスの自然な接着が安定した画像は、ほとんどの場合十分なイメージングを移動するときは注意がいる限り顕微鏡を皿します。 最高の結果を得るには、翼は翼表面の大半とこしたフラット coverglass (図 1 階) との直接接触で蛹をマウントします。翼が正しくマウントされていることを確認する自分の位置を変更する鉗子を使用して蛹をロールバックします。 サンプル画像の期間中に脱水を防ぐためには、(図 1E) 蛹の邪魔にならないように注意しながら取り付けの終わりにガラス底皿の側に蒸留水に浸した脱脂綿のフィルター紙の部分を追加します。ふたが付いている皿をカバーします。注: 蛹は負傷とイメージングする準備が整いました。 3 ショウジョウバエ蛹翼の負傷レーザー誘起 波長可変レーザー アブレーション システムを搭載した広視野顕微鏡にマウントされた蛹を含むガラス底皿に転送します。 使用パルス UV 空冷窒素励起アブレーション レーザー調整 435 nm の – 詳細11;材料の表を参照してください照明用光源の発振波長の精密は、適切な色素細胞を介してユーザーによって選択されます。 検索する最初の蛹の蛹の翼に顕微鏡ステージ コントロールを調整明視野光学系を用いた (図 1 f) が負傷。 最適な結果を得るには、両方のイメージングのためオイル 40 X または 63 X は水浸対物レンズを使用し、レーザーアブレーション;使用する浸漬液 (油またはグリセロール) はアブレーションやイメージング システム間での一貫性を確認します。ガラス基板 (すなわち負傷する上皮の領域にフォーカス) に最も近い蛹翅上皮の平面に焦点を当てるために、顕微鏡の調整細かいフォーカス コントロールつまみを使用して。 顕微鏡ステージの調整を使用すると、負傷する領域が直接アブレーション レーザーの既知のターゲット領域と揃うように蛹翅を位置します。 アブレーション光の電力レベルを手動で調整するのにには、顕微鏡に装着エネルギー密度減衰器スライドを使用します。注: 減衰スライダーはクリック ストップと相対的なレベルの減衰量を特定し、再現性の設定の使用を許可する判決。 外部手動トリガーコントロールを使用すると、トリガーの 1 回の簡単なクリックを使用して傷をするアブレーション レーザーをアクティブにします。それをチェック アブレーション サイトで一時的な気泡の外観の負傷は通常添付されますので。レーザー誘起負傷されているかどうか蛹の上皮を視覚化する適切な蛍光フィルターを使用して成功を確認します。注: ビーム反射や皮膚障害が厳しい目を生じることができるレーザ光線への偶発的な暴露を避けるために注意してください。 負傷したが成功した場合 (現在の焦点のレベルの上下にかかわらず若干顕微鏡フォーカスを移動) 焦点面を変更し、アブレーション トリガーの 1 回のクリックを繰り返します。また、望ましい創傷サイズが達成されるまで減衰器スライドを使用してレーザー パワーが徐々 に増加します。 リアのコントロール パネルの繰り返しノブを使ってアブレーション レーザー パルスの繰り返し周波数を変化させる (より小さい 1 パルス/秒から速度を変更する 60 Hz)。最適な負傷のパルス繰り返し周波数を 40 Hz に設定します。 別のサイズの傷を生成するのにには、手動でアブレーション光パワーレベルを調整するのにエネルギー密度減衰器スライドを使用します。 すべてのマウントの蛹が負傷した控えるし、無傷のコントロールとしてこれらの非アブレーションの蛹を使用します。 一貫性のある結果 (関連する取扱説明書を使用して) レーザーアブレーション システムを定期的に再編成します。また、クリーニングし、レーザー出力波長を制御する色素共振器電池を補充します。 4.体内タイムラプス顕微鏡を用いたイメージング タイムラプス イメージングのための適切な顕微鏡にガラス底皿をすばやく転送します。注: 最適な結果を得るのためには、高仕様共焦点または GFP と mCherry の両方の蛍光物質を検出できる検出器を搭載した回転ディスク顕微鏡を使用します。 全体の蛹の翼をイメージ、低倍率 (例: 20 X) 対物レンズ (図 2 a) を使用します。傷のイメージの修復や高空間解像度とそれに伴う炎症反応のために使用油浸漬 40 X (NA 1.3) または (図 2B-Dの代表的な画像を参照) (NA 1.4) 対物レンズ × 63。 顕微鏡に関連付けられている適切なイメージ キャプチャ ソフトウェアを開きます。 イメージ キャプチャ ソフトウェアを使用して、適切なレーザーなど488 nm とそれぞれ (関連するボックスをクリック) によって GFP と mCherry の同時を視覚化とレーザー パワーを調整ゲイン/オフセットを与えるため設定して 561 nm のレーザーをオンに十分な蛍光信号ピクセルの彩度を避けながら退色と光毒性を最小限にする (5-20% の範囲) の最低の可能なレーザー パワーを使用します。 両方修理をキャプチャする上皮と炎症性細胞の動員、設定コントロール パネルの微小焦点調整ノブを使用して z を記録する顕微鏡最適な結果を得るには、ソフトウェアを設定 (手動ボタン クリックを使用して) (すべて 3 mm 最小)、蛹を経てレコード z スライスする (移行血球を含んでいる) の下に細胞外スペースにによって負傷した上皮の上から大規模な達成するために(50 〜 100 ミリメートルの範囲) で z スタック。 タイムラプス イメージングの定期的な間隔で z スタックを記録 (最小あらゆる 30 s) 少なくとも 1 h の後負傷のため。注: z スタック選択間の正確な時間間隔は、急速に変化する細胞動態をキャプチャとサンプルの写真漂白を避けることのトレードオフを表します。 同時に複数の蛹 (非アブレーションかん水コントロールを含む) のイメージは、(顕微鏡に接続) 電動ステージとイメージング ソフトウェアの内で利用できるマルチ ポジション獲得機能を使用します。ステージ位置制御ノブを使用してソフトウェアのそれぞれの個々 の蛹の位置を手動で設定し、それぞれの個々 の蛹の適切な z スタック制限 (上部と下部) を手動で設定。 Z スタック投射または 3-D レンダリングを使用してコマ撮り画像画像キャプチャの実行中または後専門画像解析ソフト (ImageJ32) などで可視化します。たとえば、各血球の動きに従うこと (図 2’のように、 D’)、オープン アクセス ImageJ プラグイン”TrackMate”または「手動トラッキング」( 33,の公開されたメソッドを使用してトラック血球核34)。 選択的に photoconvert (楓30) などの蛍光プローブを使用し、イメージ投射の間上皮や免疫細胞のサブセットをラベルします。 光変換を実行するイメージング ソフトウェア内で適切なモジュールを開く (FRAP、光退色後蛍光回復などモジュール) 405 nm レーザー (関連するソフトウェア ボックスで] をクリック) で35をアクティブにします。 正方形、円形またはフリーハンド選択ツールを使用して FRAP ソフトウェア内で photoconverted をするセルを選択します。FRAP ソフトウェア内で 1 つのイテレーション/フレーム光電 (漂白) の時間経過を設定し、20% レーザー パワーで 405 nm レーザーします。手動で光変換を実行する実験を開始をクリックします。 FRAP モジュール (閉じるをクリック) を終了し、ソフトウェア内で元画像の画面に戻ります使用、488 nm と z と上記のコマ撮り録画を設定して photoconverted と非 photoconverted のセルの動作をイメージする 561 nm のレーザーです。注: Photoconverted プローブは、(少なくとも 5 時間) の期間の後に photoconverted セルの動作を有効にする最初の光電後何時間も安定しています。たとえば、傷に炎症性細胞が選択的に photoconverted (図 2 f) することができます、彼らの行動は後から損傷部位 (図 2 と H) を解決するとき。