Protocolli sono descritti per valutare la tossicità delle chimiche alle zanzare immature e adulte per lo sviluppo come nuove classi di larvicidi, adulticides ed endectocidi. I protocolli consentono un elevato throughput test delle chimiche multiple a punto singolo dose e successiva valutazione tramite test di risposta dose per determinare la tossicità per contatto o ingestione.
Nuove classi di insetticidi con nuovi modi di azione sono necessari per controllare insetticida resistente popolazioni di zanzare che trasmettono malattie quali malaria, dengue e Zika. Saggi per una rapida, analisi di alto-rendimento delle chimiche inespressi romanzo contro adulti e larve di zanzara sono presentati. Descriviamo protocolli per singola punto-dose e dose risposta saggi per valutare la tossicità delle chimiche di piccola molecola al vettore Aedes aegypti di Zika, dengue e febbre gialla, il vettore della malaria, Anopheles gambiae e il Nord zanzara di casa, Culex quinquefasciatus, sul contatto e via ingestione. Ad esempio, abbiamo valutato la tossicità di amitriptilina, un antagonista di piccola molecola di recettori accoppiati a proteine G, via larvale, adulto d’attualità e adulto sangue-alimentazione analisi. I protocolli forniscono un punto di partenza per studiare il potenziale di insetticida. I risultati sono discussi nel contesto di ulteriori esperimenti per esplorare le applicazioni del prodotto e i meccanismi di consegna.
Le zanzare trasmettere gli agenti causali di malattie infettive che influiscono sulla salute umana a livello globale1. I tre generi di zanzara più importanti che incidono sulla salute umana sono Aedes, Anopheles e Culex. Specie di zanzare Aedes vector arbovirus che causano Zika, dengue, febbre gialla e chikungunya. Specie Anopheles vector parassiti della malaria e specie Culex trasmettere virus West Nile e filarie2. L’organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha chiamato per l’eradicazione di dieci trascurato tropicali malattie (NTD) dal 20203 e identificato il controllo delle zanzare come la strategia più valida. Gli insetticidi sono strumenti potenti per controllare le zanzare e ridurre malattia trasmissione4,5. Tuttavia, l’emergere delle popolazioni di zanzare insetticida-resistente minaccia al controllo costante di molte malattie6,7,8. Il Consorzio innovativo di controllo vettoriale (IVCC) ha lanciato il primo sforzo dedicato a sviluppare gli insetticidi di sostituzione per zanzara controllo9. Nuovi insetticidi con nuove modalità di azione (MoA) sono necessari per soddisfare che obiettivi e ottenere il controllo delle malattie. La scoperta e lo sviluppo di nuove classi di insetticida con romanzo MoAs richiedono dosaggi di tutto l’organismo per l’analisi rapida, ad alta produttività di componenti chimici e in confronto ad industria standard10.
Saggi multipli sono disponibili per valutare l’idrorepellenza e la tossicità degli insetticidi per zanzare adulte e larve, e alcune sono adatte per la valutazione di nuovi processi chimici formulati o inespressi. Il protocollo WHO11 è un dosaggio di contatto utilizzato per testare i prodotti contro le larve instar quarto. Studi pubblicati anche descrivono una varietà di analisi larvale usato per testare la tossicità dei prodotti chimici per piccola molecola alle larve di Aedes aegypti, Anopheles gambiae e Culex quinquefasciatus10,12, 13,14,15,16. I Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottiglia analisi biologica viene utilizzato per valutare la resistenza agli insetticidi in campo catturato popolazioni di zanzare adulte tramite valutazione di concentrazione letale (LC) e tempo letale (LT) in confronto ad uno standard diagnostico dose di un insetticida commerciale17. Il test di suscettibilità di OMS offre un altro approccio per valutare la resistenza agli insetticidi in adulte zanzare per cui le zanzare sono esposti a carta impregnata di insetticida all’interno di fiale di vetro per 1 h e mortalità è valutata a 24 h18. Altri saggi spruzzare formulazioni all’interno di gabbie sigillate e atterramento di zanzara record e la morte desiderata punti temporali19. L’applicazione topica sul torace di zanzara è stato utilizzato per valutare la potenza di diversi pesticidi20. Il Liverpool insetto test istituzione (LITE)21 si avvale di procedure operative Standardper valutare la bioattività delle chimiche alle zanzare adulte. Il dosaggio topico adulto LITE si applica una piccola quantità di prodotto in esame al torace di zanzare adulte con mortalità segnato a 48 h. L’analisi consente di quantificazione della dose ricevuta per singoli zanzara21. Il dosaggio tarsale LITE valuta la tossicità del prodotto in esame per le zanzare adulte che riposa su una superficie trattata chimicamente e viene utilizzato per identificare le composizioni chimiche con potenziale di sviluppo come spray residua interna (IRS) o utilizzare in zanzariere da letto trattata di insetticida (ITN) per controllare le zanzare anofele .
L’OMS e CDC saggi hanno limitazioni per le prove chimiche di romanzo, inespressi, e l’obiettivo di analisi biologica bottiglia CDC è la valutazione della suscettibilità per periodi di breve saggio (due ore) piuttosto che tossicità22,23. Inoltre, saggi per valutare la tossicità delle sostanze chimiche consegnato durante il pasto di sangue e potenziali per lo sviluppo di prodotti ad azione sistemica (cioè, endectocidi) sono carenti. Qui, descriviamo le analisi per testare l’attività mosquitocidal di nuovi processi chimici che sono solubili in acqua o in uno dei vari solventi organici contro le larve e adulti di Aedes, Anopheles e Culex. In primo luogo, dimostriamo un dosaggio larvale precedentemente descritto dal nostro gruppo10,12,13,16e qui eseguito come (1) uno schermo per valutare rapidamente processi chimici multipli ad un singolo punto della dose, e (2) un’analisi di risposta dose per determinare la concentrazione letale (ad es., LC50, LC75 o LC90,) di un singolo chimica. Successivamente, descriviamo due adulte analisi per la determinazione della dose mortale (LD). Il primo di questi è un adattamento del protocollo LITE per il collaudo di componenti chimici applicati per via topica, romanzo contro le zanzare adulte rispetto ad un controllo positivo. Il secondo è un saggio di alimentazione per la valutazione delle chimiche tramito sistematicamente il pasto di sangue.
Gli insetticidi sono potenti strumenti per combattere le malattie trasmesse dalle zanzare come25di malaria, dengue e Zika26. Insetticida di vasto uso ha prodotto popolazioni di zanzare che sono resistenti alla lotta chimica, leader per lo sviluppo della resistenza agli insetticidi, che è considerata la più grande minaccia per continuato controllo delle malattie. L’ultimo decennio ha visto un aumento drammatico nelle popolazioni di Anopheles spp. resistente ai piretroidi sintetici (SPs) utilizzati in reti da letto in Africa7. Popolazioni di Aedes albopictus, un vettore di dengue e Zika, sono stati segnalati in Florida e New Jersey che sono resistenti a organofosfati6. Allo stesso modo, la resistenza al DDT e piretroidi è stata documentata in popolazioni di Anopheles e Aedes spp in Colombia27,28. C’è bisogno urgente di sviluppare nuove larvicidi e adulticides che si legano a diversi ortosterici o siti allosterici su bersagli molecolari noti o che disturbare nuovi obiettivi (cioè, romanzo chimiche di MoA)29,30 e hanno un impatto ambientale minimo. C’è in aumento anche il riconoscimento del potenziale intorno endectocidi per zanzara controllo31,32,33.
Per facilitare il rapido sviluppo di tali prodotti, descriviamo una serie di protocolli volti a valutare la tossicità dei prodotti chimici per piccola molecola di larve di zanzara e adulti tramite due percorsi di consegna – contatto e ingestione. Protocolli come il test di suscettibilità di OMS e il dosaggio di bottiglia di CDC sono di uso comune per valutare la tossicità e la repellenza di esistente formulazioni insetticide1,2. Tuttavia, queste analisi hanno limitazioni per le analisi di entità chimiche romanzo inespressi (NCEs) e non sono favorevoli a un numero elevato di processi chimici di prova della moderata o elevata velocità effettiva.
Qui descriviamo un’analisi larvale standard per valutare rapidamente NCEs nella dose di singolo punto che possa essere scalate per analisi di produttività elevata. Inoltre descriviamo un adattamento di un’analisi sviluppata da LITE21 per valutare la tossicità Contatta delle chimiche di piccola molecola alle zanzare adulte. Infine, descriviamo un saggio di ingestione per valutare la tossicità di NCEs consegnati tramite il pasto di sangue per le zanzare femmina adulte ed esplorare endectocide potenziali. Queste analisi larvale e adulte possono essere eseguite in una gamma di dosi al fine di determinare i valori di LC e LD, rispettivamente, e saggi di contatto sia larvale e adulti possono essere eseguiti rispetto ad una o più formulazioni chimiche esistenti. Il dosaggio topico adulto consente inoltre il calcolo dei valori di LD per singolo zanzara. I protocolli possono essere eseguiti utilizzando specie di Aedes, Anopheles e Culex16,29 e potrebbero essere modificati per accogliere le specifiche caratteristiche biologiche di una specie, se lo si desidera. Nella nostra esperienza, mosquitocidal chimiche esibiscono tipicamente vasta attività attraverso questi tre generi16,29, ma non c’è valore alla valutazione della selettività di specie.
I dosaggi sono un punto di partenza per schermo rapidamente più chimiche per attività insetticida. Quei processi chimici che presentano tossicità in uno o più saggi potrebbero essere selezionati per ulteriori analisi tramite analisi secondarie e terziarie. Gli esempi includono il dosaggio tarsale LITE e lo zucchero alimentazione saggi34,35. La selezione di ulteriori saggi è in genere determinata da considerazioni nei dintorni di mercato atteso e applicazione, con risultati fornendo spunti per modalità di consegna del prodotto possibile. Nei risultati della rappresentativi mostrati qui, esploriamo la tossicità di amitriptilina, un antagonista dei recettori dopaminergici mammiferi e invertebrati marini che di potenziale è stato valutato come un romanzo MoA insetticida10,12, 13 , 16. amitriptilina ha esibito la tossicità di larve e adulti di Ae. aegytpi in μg gamma suggerendo larvicida e adulticida attività e fornendo spiegazione razionale per un’esplorazione di una serie di chimica di base di amitriptilina per identificare analoghi con potenza elevata. In Ae. aegypti esposti ad amitriptilina nel pasto di sangue è stato osservato alcun effetto significativo sulla mortalità o fecondità. Mentre la stabilità della chimica nel sangue defibrinato e dose efficace ricevute al zanzara non è noto, notevoli limitazioni del test, i dati suggeriscono che amitriptilina e altri composti attivi GPCR possono avere poco potenziale come endectocidi, alle almeno in stato inespressi.
Precauzioni per limitare la variazione biologica tra i test sono essenziali. Tutte le analisi devono essere eseguite in condizioni standard di temperatura e umidità, preferibilmente in una camera di crescita degli insetti, al fine di garantire la riproducibilità. È assolutamente necessario standardizzare le procedure per segnare punti finali fenotipici come questi possono essere altamente soggettivi, che porta ad una variazione significativa dei dati registrati da personale di laboratorio diversi. Il dosaggio larvale è più adatto alla valutazione dei processi chimici che sono solubili in acqua, anche se il dosaggio può essere effettuato utilizzando solventi organici come DMSO, purché la concentrazione finale è inferiore all’1% per pozzetto. Riconosciamo diversi limiti per l’adulto dosaggio topico. In primo luogo, è necessario lavorare rapidamente quando preparare diluizioni seriali e consegnare le dosi come il vettore (acetone) è altamente volatile ed evaporazione può produrre variazione nella quantità di chimica consegnato. In secondo luogo, si dovrebbe prestare attenzione a limitare il periodo di anestesia come questo può contribuire alla mortalità. Si deve anche osservare che solventi quali l’acetone possono produrre un effetto rapido “knock-down” nelle parecchie ore prime del test d’attualità, che non deve essere confuso con effetti a causa della chimica di prova. Notiamo che il volume del pasto di sangue di zanzare varia tra gli individui, che complica una valutazione della dose ricevuta per adulto nel dosaggio adulto ingestione. Infine, analisi dati non devono essere considerati in casi dove la mortalità nel controllo negativo supera il 10%.
Prodotti che agiscono in sinergia sempre più sono riconosciuti per il loro potenziale di estendere l’utilità dei prodotti esistenti e forniscono il controllo di parassiti resistenti insetticida popolazioni15,16,36. Analisi larvali sono state usate per esaminare il sinergismo fra il pesticida formammidina, amitraz e una varietà di composizioni chimiche che interrompono invertebrati octopamina recettori14,15. L’analisi larvale e adulto dosaggio topico descritto sono adatti per la valutazione di effetti sinergici o additivi tra combinazioni di prodotti chimici per test. Notiamo che sinergizzanti come piperonil butossido (PBO) possono essere incorporati in ciascuno dei tre saggi descritti qui.
Le analisi sopra descritte forniscono una serie sperimentale standardizzata per la valutazione dei farmaci inespressi, piccola molecola contro le fasi della vita acquatica e terrestre zanzara. Queste analisi sono progettate specificamente per valutare la tossicità e offrono diversi vantaggi rispetto dei genitori saggi in comune uso. D’importanza, i dosaggi sono favorevoli all’automazione e possono essere eseguiti su scala industriale per consentire la valutazione di migliaia di sostanze da testare. Infine, come il campo ritiene che lo sviluppo di prodotti che agiscono tramite nuove MoAs, tra cui via rottura di nuovi bersagli molecolari e le vie biochimiche, sarà essenziale per segnare più endpoint fenotipiche oltre a quelle come la mortalità e paralisi. Le analisi di cui sopra consentono tali indagini, fornendo così un passo verso tecnologie altamente innovative, insetticida di domani.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano H. Ranson, Liverpool School of Tropical Medicine per assistenza con sviluppo di analisi e predisposizione del protocollo LITE, e M. Scharf, Purdue University per la consulenza in materia di analisi di design.
Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | – | Tool needed for topical application experiments |
24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | – |
Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | – | Used to seal the paper cups |
Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
Tulle fabric, white | Walmart | – | – |
Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | – | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
Tweezers (fine) | Fontax | – | Used to handle adult mosquitoes |