Protokolle sind für die Bewertung der Toxizität von Chemikalien zu unreif und Erwachsene Mücken für Entwicklung als neue Klassen von Larviziden, Adulticides und Endectocides beschrieben. Die Protokolle ermöglichen Hochdurchsatz-Prüfung von mehreren Chemikalien bei Einzelpunkt-Dosis und anschließende Auswertung über Dosis-Antwort-Assay Toxizität auf Kontakt zu bestimmen oder Verschlucken.
Neue Klassen von Insektiziden mit neuartigen Wirkmechanismen sind erforderlich, um Insektizide resistenten Populationen von Moskitos zu steuern, die Krankheiten wie Zika, Dengue-Fieber und Malaria übertragen. Assays für Rapid, werden Hochdurchsatz-Analysen der unformulated Roman Chemikalien gegen Moskitolarven und Erwachsene präsentiert. Wir beschreiben Protokolle für Punkt-Einzeldosis und Dosis-Antwort-Assays auszuwertende die Toxizität von niedermolekularer Chemikalien dem Aedes Aegypti Vektor von Zika, Dengue-Fieber und Gelbfieber, Malaria-Vektor, Anopheles Gambiae und der nördlichen Haus Mücke, Culex Quinquefasciatus auf Kontakt und durch Verschlucken. Als Beispiel haben wir die Toxizität von Amitriptylin, ein kleines Molekül Antagonist von G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren, über Larven, Erwachsene aktuell und Erwachsenen Blut-Fütterung-Test ausgewertet. Die Protokolle stellen einen Ausgangspunkt um potenzielle Insektizid zu untersuchen. Ergebnisse werden im Rahmen von zusätzlichen Experimenten Produktanwendungen und Mechanismen für die Lieferung zu erkunden diskutiert.
Mücken übertragen die Erreger von Infektionskrankheiten, die menschliche Gesundheit weltweit auswirken1. Die drei wichtigsten Moskito Gattungen die menschliche Gesundheit sind Aedes, Culexund Anopheles . Arten der Aedes -Mücken Vektor Arboviren, die Zika, Dengue-Fieber, Gelbfieber und Chikungunya-Fieber verursachen. Anopheles -Arten Vektor Malaria-Parasiten und Culex -Arten, West-Nil-Virus und filarial Nematoden2übertragen. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat die Beseitigung von zehn vernachlässigten tropischen Krankheiten (NTD) von 20203 gefordert und Moskito-Kontrolle als die praktikabelste Strategie identifiziert. Insektizide sind mächtige Werkzeuge, um Mücken zu kontrollieren und reduzieren Krankheit Getriebe4,5. Die Entstehung von Insektizid-resistente Moskito-Populationen droht aber die kontinuierliche Kontrolle der viele Krankheiten6,7,8. Die innovativen Vector Control Consortium (IVCC) startete den ersten dedizierte Versuch, Ersatz Insektizide für Mosquito Control9entwickeln. Neue Insektizide mit neuartigen Wirkmechanismen (MoA) sind zu treffen, die Ziele und erreichen Seuchenbekämpfung erforderlich. Die Entdeckung und Entwicklung neuer Insektizid-Klassen mit Roman MoAs erfordern Gesamtorganismus Assays für schnelle, Hochdurchsatz-Analyse von Chemikalien und im Vergleich zu Industrie-Standards-10.
Mehrere Tests stehen die Schmutzabweisung und Toxizität von Insektiziden, Larven und Erwachsene Mücken zu bewerten, und einige eignen sich für die Bewertung von neuartigen formulierten oder unformulated Chemikalien. Die WHO Protokoll11 ist ein Kontakt Assay verwendet, um Produkte gegen vierten Instar Larven zu testen. Veröffentlichte Studien beschreiben auch eine Vielzahl von Larven Assays verwendet, um die Toxizität von niedermolekularer Chemikalien für Larven von Aedes Aegypti, Anopheles Gambiae und Culex Quinquefasciatus10,12, testen 13,14,15,16. Die Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Flasche Bioassay dient zur Insektizid Widerstand im Feld gefangen Populationen von Erwachsenen Mücken über Auswertung von letale Konzentration (LC) und tödliche Zeit (LT) im Vergleich zu einem diagnostischen Standard Bewertung Dosis von einer kommerziellen Insektizid-17. Die WHO-Empfindlichkeitstest bietet einen anderen Ansatz um Insektizid Widerstand in erwachsene Mücken zu bewerten, wobei Mücken Insektizid imprägnierten Papier innen Glasfläschchen für 1 h ausgesetzt sind und Mortalität ist bei 24 h18bewertet. Anderen Assays sprühen Formulierungen in versiegelten Käfige und Rekord Moskito Zuschlag und Tod in der gewünschten Zeitpunkten19. Topische Anwendung auf der Moskito-Thorax wurde zur Potenz der verschiedenen Pestiziden20zu bewerten. Die Liverpool Insekt Testing Einrichtung (LITE)21 beschäftigt Standard Operating Procedures, die Bioaktivität der Chemikalien auf erwachsene Mücken zu bewerten. Der LITE Erwachsenen aktuelle Test gilt ein kleines Volumen des Testprodukts für Thorax erwachsene Mücken mit Sterblichkeit erzielte bei 48 h. Der Test ermöglicht Quantifizierung der Dosis pro einzelnen Moskito21erhalten. Die LITE tarsal Assay wertet die Toxizität von Testprodukt erwachsene Mücken ruht auf einer chemisch behandelten Oberfläche und wird verwendet, um Chemikalien mit Entwicklungspotenzial als indoor residual Sprays (IRS) zu identifizieren oder die Verwendung in Insektizid behandelt Moskitonetze (ITN) Anopheles -Mücken zu steuern.
Die WHO und CDC-Assays haben Einschränkungen für die Prüfung von neuartiger, unformulated Chemikalien, und das Ziel der CDC Flasche Bioassay ist Bewertung der Empfindlichkeit über kurze Assay Zeiträume (zwei Stunden) anstatt Toxizität22,23. Darüber hinaus Assays für die Bewertung der Toxizität von Chemikalien in der Blutmahlzeit geliefert und Potenzial für die Entwicklung von systemischen wirkenden Produkten (z.B. Endectocides) fehlen. Hier beschreiben wir Assays für die Prüfung der Mosquitocidal Aktivität des neuartigen Chemikalien, die in Wasser oder eine der verschiedenen organischen Lösungsmitteln gegen die Larven und Erwachsene von Aedes, Anopheles und Culexlöslich sind. Erstens zeigen wir einen Larvenstadium Assay zuvor durch unsere Gruppe10,12,13,16beschrieben, durchgeführt und hier als (1) ein Bildschirm, um schnell mehrere Chemikalien an einem einzigen Punkt bewerten Dosis, (2) eine Dosis-Antwort-Assay die letale Konzentration (z. B. LC50, LC75 oder LC-90) einer einzigen Chemie bestimmt. Anschließend beschreiben wir zwei Erwachsene Assays für die Bestimmung der letale Dosis (LD). Die erste davon ist eine Adaption des LITE-Protokolls für die Prüfung von topisch applizierten, neuartigen Chemikalien gegen die Erwachsenen Mücken im Vergleich zu einer positiven Kontrolle. Die zweite ist eine Fütterung Assay für die Bewertung von Chemikalien über die Blutmahlzeit systemisch geliefert.
Insektizide sind mächtige Werkzeuge zur Bekämpfung von Moskitos übertragenen Krankheiten wie Malaria25, Dengue-Fieber und Zika26. Umfangreiche Insektizideinsatz produzierte Moskito-Populationen sind resistent gegen chemische Bekämpfung, führend zu die Entwicklung von Insektizid Widerstand, der gilt als die größte Bedrohung für Seuchenbekämpfung fortgesetzt. Im letzte Jahrzehnt hat einen dramatischen Anstieg der Populationen von Anopheles spp. beständig gegen synthetische Pyrethroide (SPs) verwendet in Moskitonetze in Afrika7gesehen. Populationen von Aedes Albopictus, Überträger von Dengue-Fieber und Zika, worden in Florida und New Jersey, die Organophosphate6resistent sind berichtet. In ähnlicher Weise wurde Widerstand gegen DDT und Pyrethroide in Populationen von Anopheles und Aedes spp. in Kolumbien27,28dokumentiert. Besteht dringender Bedarf, entwickeln neue Larviziden und Adulticides, die an verschiedenen Orthosteric binden oder allosterische Websites von bekannten molekulare Targets oder stören die neue Ziele (z. B. neuartige MoA Chemikalien)29,30 und haben Sie minimale Auswirkungen auf die Umwelt. Es steigt auch Anerkennung für das Potenzial um Endectocides für Moskito Kontrolle31,32,33.
Um der rasanten Entwicklung solcher Produkte zu erleichtern, beschreiben wir eine Reihe von Protokollen, die entworfen, um die Toxizität von niedermolekularer Chemikalien Moskitolarven und Erwachsene über zwei Lieferrouten – Kontakt und Einnahme zu bewerten. Protokolle wie das WHO-Empfindlichkeitstest und CDC Flasche Assays sind im allgemeinen Gebrauch für die Bewertung der Toxizität und Ölabweisung vorhandene Insektizide Formulierungen1,2. Aber diese Assays haben Beschränkungen für Analysen der unformulated neuartige chemische Einheiten (NCEs) und sind nicht geeignet, um große Anzahl von Chemikalien in gemäßigten oder hohen Durchsatz zu testen.
Hier beschreiben wir einen standard Larven Assay um schnell NCEs Einzelpunkt-Dosis zu bewerten, die für Hochdurchsatz Analysen skaliert werden können. Wir beschreiben auch eine Adaption von einem Assay entwickelt von der LITE21 , die Kontakt Toxizität von niedermolekularer Chemikalien erwachsene Mücken zu bewerten. Wir beschreiben einen Einnahme-Test zur Bewertung der Toxizität von NCEs geliefert über die Blutmahlzeit, Erwachsene weiblichen Stechmücken und erforschen potenzielle Endectocide. Diese Larven und Erwachsenen Assays können bei einer Reihe von Dosen durchgeführt werden, um LC und LD-Werte zu bestimmen, und Larven und Erwachsenen Kontakt Assays im Vergleich zu einem oder mehreren vorhandenen chemischen Formulierungen durchgeführt werden können. Die Erwachsenen topische Assay ermöglicht auch die Berechnung von LD Werte pro einzelnen Moskito. Die Protokolle können mit Arten der Aedes, Anopheles und Culex16,29 durchgeführt werden und könnte geändert werden, um Platz für die biologischen Besonderheiten einer Spezies, falls gewünscht. Nach unserer Erfahrung Mosquitocidal Chemikalien weisen in der Regel breite Wirkung auf diese drei Gattungen16,29, aber Wert zur Beurteilung der Spezies Selektivität vorhanden ist.
Die Assays sind ein Ausgangspunkt mehrere Chemikalien für Insektizide Aktivität schnell auf den Bildschirm. Diese Chemikalien, die Toxizität in einem oder mehreren Tests aufweisen konnte für weitere Analysen über sekundäre und tertiäre Assays ausgewählt werden. Beispiele hierfür sind die LITE tarsal-Assay und Zucker füttern Assays34,35. Die Auswahl der zusätzlichen Assays richtet sich in der Regel nach Überlegungen rund um erwarteten Markt- und Anwendung, mit Ergebnissen, die Einblicke zu Produkt Lieferarten. In die repräsentativen Ergebnisse hier gezeigten erforschen wir die Toxizität von Amitriptylin, ein Antagonist von Säugetieren und Wirbellosen Dopamin-Rezeptoren, die für potenzielle als Roman MoA Insektizid10,12, bewertet wurden 13 , 16. Amitriptylin ausgestellt Toxizität für Larven und Erwachsene von Ae. Aegytpi μg Bereich vorschlagen larvicidal und Adulticidal Tätigkeit sowie eine Begründung für eine Auseinandersetzung mit einem Amitriptylin-basierte chemische Serie zu identifizieren Analoga mit hoher Potenz. Keine signifikante Auswirkung auf Sterblichkeit oder Fruchtbarkeit verzeichneten Ae. Aegypti Amitriptylin in der Blutmahlzeit ausgesetzt. Während die Stabilität der Chemie in Defibrinated Blut und wirksame Dosis erhalten pro Mücke nicht bekannt ist, nennenswerte Einschränkungen des Assays, legen die Daten nahe, dass Amitriptylin und andere GPCR-aktive Verbindungen wenig Potenzial als Endectocides, bei zumindest in unformulated Zustand.
Vorkehrungen treffen, um biologische Unterschiede zwischen den Proben zu begrenzen sind unerlässlich. Alle Tests sollten unter normalen Bedingungen von Temperatur und Luftfeuchtigkeit, vorzugsweise in einer Kammer Insekt Wachstum durchgeführt werden, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Es ist zwingend notwendig, um die Standardisierung von Verfahren für das scoring phänotypischen Endpunkte, da diese sehr subjektiv, führt zu deutlichen Unterschieden in Daten von verschiedenen Laborpersonal aufgezeichnet werden können. Die Larven Assay eignet sich am besten zur Bewertung von Chemikalien, die in Wasser löslich sind, obwohl der Assay erfolgen kann, wenn die Endkonzentration ist weniger als 1 % pro Bohrloch mit organischen Lösungsmitteln wie DMSO. Wir erkennen mehrere Einschränkungen für die Erwachsenen topische Assay. Erstens ist es notwendig, schnell zu arbeiten, bei der Vorbereitung von Verdünnungsreihen und Dosen zu liefern, da der Träger (Aceton) sehr volatil ist und Verdampfung Variation in Höhe von Chemie produzieren kann geliefert. Zweitens sollte darauf geachtet werden, die Geltungsdauer der Narkose zu beschränken, da dies zur Sterblichkeit beitragen kann. Anzumerken ist, dass Lösungsmittel wie Aceton einen schnellen “Knock-down”-Effekt in der ersten mehrstündigen des aktuellen Tests produzieren können, die nicht mit Effekten aufgrund der Chemie Test verwechselt werden sollte. Wir stellen fest, dass das Volumen der Moskito-Blut-Mahlzeit zwischen Individuen, erschwert eine Bewertung der Dosis erhalten pro Erwachsener in der Erwachsenen Einnahme Test variiert. Zu guter Letzt sollte Assay-Daten nicht in Fällen gilt, wenn die Mortalität in der negativen Kontrolle 10 % übersteigt.
Produkte, die synergistisch wirken werden zunehmend anerkannt, ihr Potenzial zu erweitern das Dienstprogramm von bestehenden Produkten und ermöglichen eine Kontrolle der Insektizide resistente Schädlinge Bevölkerung15,16,36. Larven-Assays wurden zur Synergismus zwischen dem Formamidine-Pestizid, Amitraz und eine Vielzahl von Chemikalien, die Wirbellosen Octopamin Rezeptoren14,15stören zu untersuchen. Die Larven Assay und Erwachsenen topische Assay beschrieben eignen sich für additive oder synergistische Effekte zwischen Kombinationen von Chemikalien Test auswerten. Wir stellen fest, dass jeder der hier beschriebenen drei Assays Synergisten wie Piperonyl Butoxide (PBO) integriert werden können.
Die oben beschriebenen Tests bieten eine standardisierte Versuchsreihen zur Auswertung von unformulated, kleinen Molekül Medikamente gegen aquatische und terrestrische Mücke Lebensstadien. Diese Tests sind speziell für Toxizität zu bewerten und bieten mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Tests gemeinsam nutzen. Wichtig ist, die Assays sind Automatisierung zugänglich und können im industriellen Maßstab zur Bewertung von Tausenden von Testverbindungen ermöglichen durchgeführt werden. Schließlich Bereich hält die Entwicklung von Produkten, die über neue MoAs handeln, auch durch Unterbrechung der neue molekulare Targets und biochemischen Bahnen, es wird entscheidend sein, mehrere phänotypische Endpunkte zusätzlich zu denen z. B. Mortalität zu erzielen und Paralyse. Die oben genannten Tests erlauben solche Untersuchungen, wodurch es einen Schritt in Richtung Insektizide hochinnovative Technologien von morgen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken H. Ranson, Liverpool School of Tropical Medicine für Unterstützung bei der Assay-Entwicklung und Bereitstellung von LITE-Protokoll und M. Scharf, Purdue Universität für Beratung in Bezug auf Assay entwerfen.
Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | – | Tool needed for topical application experiments |
24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | – |
Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | – | Used to seal the paper cups |
Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
Tulle fabric, white | Walmart | – | – |
Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | – | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
Tweezers (fine) | Fontax | – | Used to handle adult mosquitoes |