新型杀虫化学对蚊子毒性测试规程

注: 以下规程中描述的工作所需的所有菌株和试剂以及供应商都列在材料表中。 1. 蚊虫幼虫和成人的养殖 注: 杀虫剂易感的蚊虫菌株可从疟疾研究和试剂参考资料库中获得。推荐菌株如下:埃及伊蚊利物浦 (lvp) 菌株,冈比亚木木按蚊 (kisumu1) 菌株和约翰内斯堡库蚊(jhb) 菌株。 如 nuss29所述, 在25°c 和75-85 相对湿度 (rh) 的12小时夜间循环中, 在25厘米 x40 厘米塑料托盘 (每个托盘 ~ 400 幼虫) 中培养鸡蛋中的蚊虫幼虫。喂养幼虫地面沙鼠 (埃及和冈比亚) 或片状鱼类食品 (鱼)。对于幼虫检测, 在第三幼虫阶段收集幼虫。 在上述条件下, 从中转移到塑料杯中, 放在 2 0 升塑料笼子内的中, 后部的成年蚊子。如其他地方所述, 保持20% 糖溶液中的蚊子。收集成人在3-5天后出现。 2. 幼虫接触检测 (单点剂量或剂量响应检测) 注: 该检测可使用溶于水或二甲基亚硫酸盐 (dmso) 的化学药品进行, 条件是测试井中 dmso 的最终浓度不超过1%。替代溶剂可能是一种选择, 但必须首先确认, 在接触后 72小时, 最终浓度不会造成超过10% 的死亡率。该检测可作为单点剂量或剂量反应分析进行。如果执行后者, 建议测试范围内的浓度 (最少 5), 跨越预期的 lc50。 标记透明的24孔纸巾板的井, 如图 1所示。 在 1.5 ml 管中准备测试化学的库存解决方案。 使用分析天平称量每种化学物质, 并根据溶解度特性, 在无菌 dh2o、dmso 或其他合适的有机溶剂中重新悬浮 (见图 2)。注: 计算应考虑到化学的纯度。例如, 对于99% 纯的化学物质, 在 1, 000μl 丙酮中溶解10.1 毫克, 以获得1% 的溶液。用石蜡薄膜密封, 存放在-20°c。 确定将进行评估的测试化学的最终浓度, 并使用适当的溶剂从库存溶液中相应地制备连续稀释剂。注: 化学和溶剂的浓度和体积可以用公式 c1 * v 1= c2* v 2 计算, 其中 c 1 = 样品1的浓度, c 2 = 样品浓度 2, v1=样品1和 v2 =样品2的体积。请参见图 2和表 1中所示的示例计算。 根据需要准备 10 mm 库存溶液和串行稀释剂, 以获得所需的测试浓度 (表 1b)。 利用宽孔塑料转移移液器, 将 5个 l3 幼虫转移到组织培养试验板的井中;l3 幼虫可以通过长度 (~ 2.5-3.5 毫米) 和头部囊宽度识别 ~ 0.2525 毫米24。用1毫升移液器轻轻取水, 更换所需的 ddh2o体积(见下文)。重复每次处理获得 n = 4个技术复制 (即每次处理总有20个幼虫)。 在24井试验板中的四个复制井中的每一个中添加适当的测试化学量, 并轻轻旋流板, 以确保化学的均匀混合。将板材放置在恒定条件下的试验或生长室 (例如,建议使用25°c 和 ~ 75-85 rh, 如果可能的话, 采用12小时光/12小时的暗周期)。注: 为了实验之间的重现性, 请确保在相同的环境条件下进行后续检测。 记录每口井中无死亡/无反应幼虫的数量, 记录在接触后30分钟、1、1.5、2、3、24、48和 72小时 (或替代时间点) (表 2)。轻轻轻点盘子的侧面。如果没有观察到任何运动, 用无菌牙签轻轻触摸幼虫。得分幼虫, 不响应的塔平触摸作为 “死”。注: 其他形态和行为表型可以观察到, 并可以记录。 如果需要, 使用修改后的 abbott 公式来控制死亡率是正确的, 如下所示:死亡率 (%) = (x-y) * 100/(100-Y),其中 x = 处理样本中的死亡率百分比, y = 对照组中的死亡率百分比。 图形的结果作为直方图或对数曲线使用软件的选择, 如石墨垫棱镜6或类似, 并计算致命浓度 (lc) 值相对于控件。 使用单独的一批蚊子重复检测, 以获得 n = 3 或更多的生物复制。 3. 成人局部检测 (单点剂量或剂量反应检测) 注: 成人局部检测是使用丙酮作为溶剂进行的。替代溶剂可能是一种选择, 但必须首先确认最终浓度在接触48小时后不会造成超过10% 的死亡率。该检测可作为单点剂量或剂量反应分析进行, 并用于确定致死剂量 (ld)。如果执行后者, 建议测试范围内的浓度 (至少 5), 跨越预期的 ld50。 确定完成检测所需的成年雌性蚊子的数量。注: 单种化学的点剂量检测至少需要90只蚊子 (30 种用于阳性对照, 30 种用于丙酮阴性对照, 30 种用于测试化学)。 培养3至5天龄的成年雌性蚊子, 并使用吸入器转移到单独的20毫升塑料桶 (图 3)。 标签9盎司纸杯的名称和浓度的测试化学。为每个杯子放置10厘米 x 10 厘米的网格方块和橡皮筋 (见图 4)。 选择现有杀虫剂作为阳性对照 (例如,合成拟除虫菊酯、双氟菊酯), 并在丙酮中制备1% 的库存溶液 (10μμl)。注: 计算应考虑到化学的纯度。例如, 对于99% 纯的化学物质, 在 1, 000μl 丙酮中溶解10.1 毫克, 以获得1% 的溶液。用石蜡薄膜密封, 存放在-20°c。 使用与上述相同的过程, 准备测试化学的库存解决方案。注: 许多测试化学品是高度不稳定的, 解决方案最好是在每次进行生物测定时都要新鲜。 准备从库存溶液中提取阳性控制和测试化学品的连续稀释, 如图 5所示, 使用以前用丙酮冲洗的20毫升玻璃瓶。 清除1毫升的丙酮玻璃注射器, 用丙酮填充, 并固定在调整后的微涂抹器中, 以提供0.25μl 的体积。 成批工作的 10, 使用吸入器将3-5天的成年雌性蚊子从笼子里取出, 并在冰箱或冰上的4°c 下麻醉5分钟。接下来, 将蚊子转移到培养皿中, 放在冰上长达 1 0分钟。 快速工作, 用精细的推子取出单个女性, 并使用注射器微涂抹器将0.25 微米的测试溶液应用到胸背。用解剖显微镜观察确认化学的传递, 以确保每只蚊子都能得到适当的测试化学量。 将蚊子转移到贴有标签的纸杯上, 在冰上休息, 并重复 9次, 以获得 n = 10只经过处理的蚊子。用橡皮筋固定的网状方块密封杯子中的蚊子, 并在28°c 和75-85 的恒温下转移到塑料桶或生长室 (在12小时的夜间周期内)。 重复上述实验两次, 以获得 n = 3个技术复制 (即, 总共30个蚊子) 每个治疗或控制组。 首先用测试化学重复步骤 3.7-3.10, 然后进行阳性控制。注: 如果有足够的蚊子, 另一个有用的控制措施是30个未接受测试化学或溶剂的麻醉蚊子的 “空白”。 使用记分表记录 “无死亡/无反应” 蚊子的数量, 记录在接触后30分钟、60分钟、24小时和 48小时 (或替代时间点) (表 3)。如果蚊子表现出缺乏动作, 则将其打分为 “无反应”, 定义为躺在一边或背上, 无法飞行。 如果需要, 请使用修改后的 abbott 公式更正控制死亡率, 如下所示:死亡率 (%) = (x-y) * 100/(100-Y),其中 x = 处理样本中的死亡率百分比, y = 对照组中的死亡率百分比。 将结果显示为直方图或指数曲线。对于剂量响应分析, 计算测试化学相对于对照的ld50、ld75或 ld90值。 重复检测至少两次使用单独批次的蚊子, 以获得 n = 3 或更多的生物复制。 4. 成人送血试验 (单点剂量或剂量反应测定) 收集大约 150个4-5 的成年雌性蚊子, 并转移到一个单独的笼子。如果进行剂量反应分析, 重复使用6个网箱。在喂养试验前1-24 去除糖的来源。 按上述方式制备化学库存溶液, 说明化学的纯度 (典型的库存溶液在水或盐缓冲液中为 80 mm), 然后根据需要在水缓冲液中制备连续稀释剂。 在960μl 的脱颤兔血液中加入 40μl, 以获得所需的检测浓度。将膜膜涂在进料装置上, 并用橡胶圈密封。通过移液器输送1毫升血液, 并将喂养装置连接到加热装置。 用新鲜制作的10% 乳酸溶液轻轻擦拭膜表面, 并将喂养单元放入成年蚊子的笼子中。用黑布或黑色垃圾袋覆盖笼子, 让蚊子喂一个小时。 对测试解决方案的其余部分和阴性 (仅限血液) 控制重复步骤 4.2-4.4。 喂养结束后, 将桶置于4°c 的冰箱中 5分钟, 以麻醉蚊子。清除雄性蚊子和无喂养的雌性蚊子, 并通过腹部检查, 统计和记录喂食蚊子和部分喂养蚊子的总数。 保留部分和完全喂养的雌性蚊子, 目标是每剂量至少有50只血液喂养的蚊子。 在28°c 和75-85% 的恒温下 (12小时至12小时的夜间循环), 将铲斗转移到塑料桶或生长室。 使用记分表记录0.5、1、1.5、2、24、48和72小时 (或所需的替代时间点) 的死/无反应蚊子总数 (表 4)。 在进食后的第三天, 将一个蛋杯引入笼子, 并在72小时内收集鸡蛋。在解剖显微镜下计算每次处理产生的鸡蛋总数。 计算每个治疗组的死亡率和繁殖力百分比, 作为每个治疗组和对照的喂养蚊子总数的函数。如果需要, 使用修改后的 abbott 公式来控制死亡率是正确的。 使用所选软件将毒性和繁殖力数据显示为直方图图或指数曲线 (如果执行剂量响应分析)。如果进行剂量响应分析, 则计算测试化学相对于对照的 ld50、ld 75或 ld90值。 重复检测至少两次使用单独批次的蚊子, 以获得 n = 3 或更多的生物复制。