ويرد وصف بروتوكولات لتقييم سمية كيمياء للبعوض غير ناضجة والكبار للتنمية كفئات جديدة من مبيدات اليرقات واليافعة وانديكتوسيديس. تمكين البروتوكولات الفائق اختبار كيمياء متعددة في جرعة واحدة نقطة والتقييم اللاحق الجرعة استجابة الإنزيم لتحديد السمية على جهة الاتصال أو عن طريق الابتلاع.
فئات جديدة من المبيدات الحشرية مع الرواية طرق عمل ضرورية للسيطرة على السكان مقاومة مبيدات الحشرات من البعوض التي تنقل الأمراض مثل زكى وحمى الضنك والملاريا. فحوصات للسريع، يتم عرض تحليلات الفائق لكيمياء رواية أونفورمولاتيد ضد يرقات البعوض والكبار. يمكننا وصف بروتوكولات لجرعة نقطة واحدة وجرعة استجابة فحوصات لتقييم سمية كيمياء الجزيئات الصغيرة إلى ناقل بعوض الزاعجة المصرية Zika وحمى الضنك والحمى الصفراء، ومكافحة ناقلات الملاريا، Anopheles gambiae والشمالي بيت البعوض، Culex quinquefasciatus، على الاتصال، وعن طريق الابتلاع. على سبيل مثال، نحن تقييم سمية اميتربتيلين، خصم جزيء صغير مستقبلات البروتين-إلى جانب ز، عن طريق اليرقات، والكبار الموضعية والكبار تغذية الدم المقايسة. البروتوكولات توفير نقطة انطلاق للتحقيق في المبيدات الحشرية المحتملة. وتناقش النتائج في سياق تجارب إضافية لاستكشاف تطبيقات المنتج والآليات اللازمة لإيصالها.
البعوض يحيل وكلاء المسببة للأمراض المعدية التي تؤثر على صحة الإنسان على الصعيد العالمي1. أجناس البعوض أهم الثلاثة التي تؤثر على صحة الإنسان هي بعوضة Anopheles، و الحشرات. أنواع بعوض ناقل سيتناقش التي تسبب Zika وحمى الضنك والحمى الصفراء وداء شيكونغونيا. أنواع anopheles ناقلات طفيليات الملاريا ونقل الأنواع Culex فيروس غرب النيل والحبليات فيلاريال2. وقد دعا إلى القضاء على من عشرة أهملت المدارية من الأمراض (NTD) بحلول عام 20203 منظمة الصحة العالمية (WHO) وحددت مكافحة البعوض الاستراتيجية الأكثر قدرة على البقاء. المبيدات الحشرية أدوات قوية السيطرة على البعوض، والحد من انتقال المرض4،5. ومع ذلك، ظهور السكان البعوض المقاوم للمبيدات الحشرية تهدد استمرار سيطرة العديد من الأمراض6،،من78. اتحاد مراقبة ناقلات مبتكرة (ناقلات) أطلقت أول جهد مكرس لتطوير استبدال المبيدات الحشرية ل مكافحة البعوض9. مبيدات حشرية جديدة مع وسائط جديدة للعمل (MoA) ضرورية لتحقيق أهداف منظمة الصحة العالمية، وتحقيق السيطرة على الأمراض. اكتشاف وتطوير فئات مبيدات جديدة مع الرواية مواس تتطلب فحوصات الكائن الحي كله لتحليل سريع والفائق لكيمياء ومقارنة ب معايير الصناعة10.
تتوفر فحوصات متعددة لتقييم صد والسمية للمبيدات الحشرية على يرقات البعوض البالغ، وبعضها مناسبة لتقييم رواية كيمياء صياغتها أو أونفورمولاتيد. هو بروتوكول منظمة الصحة العالمية11 مقايسة اتصال المستخدمة لاختبار المنتجات ضد يرقات الطور الرابع. تصف الدراسات المنشورة أيضا مجموعة متنوعة من الاختبارات اليرقات المستخدمة لاختبار السمية لكيمياء الجزيئات الصغيرة على يرقات بعوض الزاعجة المصرية، Anopheles gambiae و Culex quinquefasciatus10،12، 1314،،،من1516. مراكز “السيطرة على الأمراض” والوقاية منها زجاجة العينة يستخدم لتقييم مقاومة المبيدات الحشرية في الميدان القبض على السكان من البعوض الكبار عن طريق تقييم التركيز المميت (LC) والوقت قاتلة (الملازم) بالمقارنة مع معيار التشخيص جرعة من مبيد حشري التجارية17. اختبار قابلية منظمة الصحة العالمية يقدم نهجاً آخر لتقييم مقاومة المبيدات الحشرية في البعوض البالغ حيث البعوض يتعرضون لورقة مشربة مبيدات الحشرات داخل قارورة من الزجاج ح 1 ويتم تقييم معدل الوفيات في 24 ح18. فحوصات أخرى رش تركيبات داخل أقفاص مختومة والبعوض سجل ضربة قاضية والموت في تيميبوينتس المرجوة19. وقد استخدمت التطبيق الموضعي للصدر البعوض لتقييم فاعلية المبيدات المختلفة20. إنشاء اختبار الحشرات ليفربول (لايت)21 تستخدم إجراءات التشغيل الموحدةلتقييم بيواكتيفيتي لكيمياء للبعوض البالغ. ينطبق التحليل الموضعي الكبار لايت كمية صغيرة من المنتج اختبار على الصدر البعوض البالغ مع وفيات سجلت في ح 48. التحليل يمكن تحديد كمية الجرعة المتلقاة في البعوض الفردية21. والرزن الرصغي لايت بتقييم سمية اختبار المنتج للبعوض البالغ يستريح على سطح كيميائيا ويستخدم لتحديد كيمياء مع إمكانات للتنمية بخاخ المتبقية داخلي (IRS) أو استخدام في الناموسيات (الناموسيات) للسيطرة على البعوض Anopheles .
منظمة الصحة العالمية وفحوصات الأمراض على قيود لاختبار كيمياء الرواية، أونفورمولاتيد، وهدف الحشري زجاجة منها تقييم قابلية على مدى فترات قصيرة بالانزيم (ساعتين) بدلاً من سمية22،23. وباﻹضافة إلى ذلك، فحوصات لتقييم سمية كيمياء تسليمها في وجبة الدم والمحتملة لتطوير منتجات الجهازية النيابة (أي، انديكتوسيديس) تنقصها. هنا، يمكننا وصف فحوصات لاختبار نشاط موسكويتوسيدال كيمياء الرواية التي قابلة للذوبان في الماء أو في واحدة من العديد من المذيبات العضوية ضد اليرقات والكبار من بعوضة Anopheles و الحشرات. أولاً، علينا أن نبدي مقايسة يرقات سابقا وصف لدينا مجموعة10،،من1213،16، وتؤدي هنا ك (1) جرعة شاشة لتقييم سرعة كيمياء متعددة عند نقطة واحدة، و (2) جرعة استجابة الإنزيم لتحديد تركيز القاتلة (مثل LC50، LC75 أو LC90،) الكيمياء واحد. بعد ذلك، يصف لنا فحوصات الكبار اثنين لتحديد الجرعة المميتة (دينار). وأول هذه تعديلاً للبروتوكول لايت لاختبار كيمياء المطبقة موضعياً، رواية ضد البعوض البالغ بالمقارنة مع عنصر تحكم إيجابية. والثاني مقايسة تغذية لتقييم كيمياء تسليم عناصره عبر وجبة الدم.
المبيدات الحشرية أدوات قوية لمكافحة الأمراض المنقولة بالبعوض مثل25من الملاريا وحمى الضنك و Zika26. استخدام المبيدات الحشرية واسعة النطاق قد أنتجت البعوض السكان هي مقاومة لمراقبة المواد الكيميائية، مما يؤدي إلى تطوير مقاومة المبيدات الحشرية، الذي يعتبر أكبر تهديد منفرد لاستمرار السيطرة على الأمراض. شهد العقد الماضي زيادة هائلة في السكان من Anopheles spp. مقاومة لمركبات البيرويثرويد الاصطناعية (SPs) المستخدمة في الناموسيات في أفريقيا7. أبلغ السكان Aedes albopictus، ناقل حمى الضنك وزكى، في ولاية فلوريدا ونيوجيرسي التي تقاوم الفوسفاتية6. وبالمثل، تم توثيق المقاومة لمادة الدي دي تي ومركبات البيرويثرويد في السكان، و بعوض Anopheles spp. في كولومبيا27،28. هناك حاجة ملحة لتطوير مبيدات اليرقات الجديدة واليافعة التي تربط أورثوستيريك المتنوعة أو مواقع اللوستيريك على أهداف جزيئية المعروفة أو التي تعطل29،الأهداف (أي رواية كيمياء MoA) الجديد30 و يكون الحد الأدنى من الأثر البيئي. ويتزايد أيضا الاعتراف بالإمكانات حول انديكتوسيديس للبعوض التحكم31،،من3233.
لتسهيل التطور السريع لهذه المنتجات، ونحن تصف سلسلة من البروتوكولات التي تهدف إلى تقييم سمية كيمياء الجزيئات الصغيرة ليرقات البعوض والكبار عبر طريقين التسليم-الاتصال والابتلاع. بروتوكولات مثل اختبار قابلية منظمة الصحة العالمية والمقايسة زجاجة منها تستخدم مشتركة لتقييم السمية وطرد من تركيبات مبيدات الحشرات الموجودة1،2. بيد أن هذه الاختبارات قيود لإجراء تحليلات للكيانات الكيميائية رواية أونفورمولاتيد (الامتحانات) وغير قابلة للاختبار أعدادا كبيرة من كيمياء في الإنتاجية متوسطة أو عالية.
هنا يصف لنا مقايسة يرقات قياسية لسرعة تقييم الامتحانات في نقطة واحدة بالجرعات التي يمكن قياس لتحليل الإنتاجية العالية. كما يصف لنا تكييف مقايسة وضعتها لايت21 تقييم سمية الاتصال كيمياء الجزيئات الصغيرة للبعوض البالغ. وأخيراً، وصف مقايسة ابتلاع لتقييم السمية لتسليمها عن طريق تناول وجبة الدم للبعوض الإناث البالغات من الامتحانات التنافسية الوطنية واستكشاف انديكتوسيدي المحتملة. يمكن إجراء هذه الاختبارات اليرقات والكبار في طائفة من جرعات بغية تحديد القيم LC ودينار، على التوالي، ويمكن إجراء فحوصات الاتصال اليرقات والكبار على حد سواء بالمقارنة مع واحد أو أكثر من التركيبات الكيميائية الموجودة. الفحص الموضعي الكبار يمكن أيضا حساب قيم LD كل البعوض الفردية. البروتوكولات يمكن أن يؤديها باستخدام أنواع بعوض Anopheles و Culex16،29 ويمكن تعديله لمراعاة الخصائص البيولوجية للأنواع، إذا رغبت في ذلك. في تجربتنا، كيمياء موسكويتوسيدال يحمل عادة نشاط واسع النطاق عبر هذه الثلاثة أجناس16،29، ولكن هناك قيمة لتقييم الأنواع الانتقائية.
فحوصات نقطة انطلاق سرعة الشاشة كيمياء متعددة لنشاط إبادة الحشرات. ويمكن اختيار تلك كيمياء أن المعرض سمية في واحد أو أكثر من الاختبارات لمزيد من التحليلات عن طريق فحوصات التعليم الثانوي والعالي. وتشمل الأمثلة الإنزيم الرصغي لايت والسكر في تغذية فحوصات34،35. التحديد لفحوصات إضافية تحددها عادة الاعتبارات حول السوق المتوقعة والتطبيق، مع نتائج تقديم رؤى لأوضاع تسليم المنتج ممكن. وفي النتائج الممثل هو موضح هنا، نستكشف سمية اميتربتيلين، خصم مستقبلات الدوبامين الثدييات واللافقاريات التي تم تقييم لإمكانيات كرواية وزارة الزراعة المبيدات الحشرية10،12، 13 , 16-اميتربتيلين أظهرت سمية اليرقات والكبار من عبد اللطيف. أيجيتبي في اقتراح مجموعة ميكروغرام مبيد والنشاط أدولتيسيدال، وتوفير الأساس المنطقي لاستكشاف مجموعة المواد الكيميائية المستندة إلى اميتربتيلين لتحديد نظائر بفاعلية عالية. أي تأثير كبير على معدل الوفيات أو خصوبتها لوحظ في Ae. مصرية تتعرض اميتربتيلين في وجبة الدم. في حين لا يعرف استقرار الكيمياء في ديفيبريناتيد الدم والجرعة الفعالة المتلقاة في البعوض، والقيود الملحوظة للمقايسة، توحي البيانات قد يكون اميتربتيلين وغيرها من المركبات النشطة GPCR احتمال ضئيل انديكتوسيديس، في الدولة أونفورمولاتيد في الأقل.
إجراءات وقائية للحد من الاختلاف البيولوجي بين فحوصات ضرورية. ينبغي إجراء فحوصات جميع الظروف القياسية لدرجة الحرارة والرطوبة ويفضل أن يكون ذلك في دائرة لنمو حشرة، بغية ضمان إمكانية تكرار نتائج. لا بد من توحيد الإجراءات للتهديف اندبوينتس المظهرية كهذه يمكن أن تكون موضوعي إلى حد كبير، مما يؤدي إلى تباين كبير في البيانات المسجلة بالعاملين في المختبرات المختلفة. والرزن اليرقات الأنسب للتقييم لكيمياء قابلة للذوبان في الماء، على الرغم من أن يمكن إجراء الفحص استخدام المذيبات العضوية مثل [دمس] شريطة أن يكون التركيز النهائي أقل من 1 في المائة أيضا. نسلم بالعديد من القيود على الفحص الموضعي الكبار. أولاً، من الضروري العمل بسرعة عند إعداد تخفيف المسلسل وتقديم جرعات الناقل (الأسيتون) درجة عالية من التقلب والتبخر قد ينتج الاختلاف مبلغ الكيمياء تسليمها. ثانيا، ينبغي الحرص على تحديد الفترة التخدير كهذا يمكن أن يسهم في معدل الوفيات. كما تجدر الإشارة إلى أن المذيبات مثل الأسيتون يمكن أن تنتج أثرا “تدق لأسفل” سريع في أول عدة ساعات للمقايسة الموضعية، التي ينبغي عدم الخلط مع الآثار الناجمة عن اختبار مادة الكيمياء. ونلاحظ أن حجم وجبة دم البعوض يختلف بين الأفراد، وتعقيد تقييما للجرعة التي تلقي كل شخص بالغ في الفحص ابتلاع الكبار. وأخيراً، لا ينبغي تحليل البيانات في الحالات التي يتجاوز فيها معدل الوفيات في مراقبة سلبية 10%.
هي المنتجات التي تتصرف تآزر على نحو متزايد لإمكاناتها توسيع الأداة المساعدة للمنتجات القائمة وتوفير المراقبة لمقاومة مبيدات الآفات السكان15،،من1636. وقد استخدمت فحوصات اليرقات لدراسة التآزر بين مبيدات الآفات فورماميديني، أميتراز ومجموعة متنوعة من كيمياء التي تعطل octopamine اللافقارية مستقبلات14،15. والرزن اليرقات والمقايسة الموضعية الكبار ووصف مناسبة لتقييم الآثار التآزرية أو المضافة بين مجموعات من اختبار كيمياء. ونلاحظ أن سينيرجيستس مثل طريقة ببيرونيل (PBO) يمكن إدراجها في كل من الاختبارات الثلاثة الموضحة هنا.
تقديم فحوصات الموصوفة أعلاه سلسلة تجريبية موحدة لتقييم العقاقير جزيء الصغيرة، أونفورمولاتيد ضد البعوض المائية والأرضية مراحل الحياة. هذه الاختبارات صممت خصيصا لتقييم السمية وعرض العديد من المزايا القائمة فحوصات المشتركة الاستخدام. الأهم من ذلك، فحوصات قابلة للتشغيل الآلي للمكاتب، ويمكن أن يؤديها على نطاق صناعي التمكين من تقييم لآلاف مركبات الاختبار. أخيرا، كما تعتبر المجال تطوير المنتجات التي تعمل عن طريق مواس جديدة، بما في ذلك عن طريق تعطيل أهداف جزيئية الرواية والمسارات البيوكيميائية، سيكون من الضروري لنقاط النهاية المظهرية متعددة بالإضافة إلى تلك مثل معدل الوفيات و الشلل. فحوصات أعلاه تسمح بمثل هذه التحقيقات، وبالتالي توفير خطوة نحو تكنولوجيات إبادة الحشرات مبتكرة للغاية في الغد.
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون H. رانسون، “مدرسة ليفربول للطب المداري” للمساعدة في تطوير التحليل وتوفير البروتوكول لايت، وتصميم م. شارف، جامعة بوردو للحصول على المشورة فيما يتعلق بالتحليل.
Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | – | Tool needed for topical application experiments |
24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | – |
Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | – | Used to seal the paper cups |
Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
Tulle fabric, white | Walmart | – | – |
Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | – | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
Tweezers (fine) | Fontax | – | Used to handle adult mosquitoes |