Описываются протоколы для оценки токсичности химия для незрелых и взрослых комаров для развития как новые классы ларвициды, особями и endectocides. Протоколы позволяют высок объём тестирование нескольких химия в одной точке дозы и последующей оценки через дозы ответ анализа для определения токсичности на контакт или проглатывания.
Новые классы инсектицидов с роман видов действий необходимы для управления инсектициды устойчивых популяций комаров, которые передают заболевания как Зика, денге и малярия. Анализы для быстрого, представлены высок объём анализ unformulated Роман химия против личинок комаров и взрослых. Мы описываем протоколы для одной точки дозы и дозы ответа анализов для оценки токсичности малые молекулы химия Aedes aegypti вектор Зика, денге и желтая лихорадка, малярия вектор, Anopheles gambiae и Северной Дом комаров, Culex quinquefasciatus, на контакт и через проглатывание. В качестве примера мы оценивали токсичность амитриптилин, антагонистом малые молекулы G белка-рецепторы, через личинок, взрослых актуальные и взрослых крови кормления пробирного. Протоколы обеспечивают отправной точкой для расследования инсектицидами потенциал. Результаты обсуждаются в контексте дополнительных экспериментов для изучения продукта приложений и механизмы доставки.
Комары переносчиками возбудителей инфекционных заболеваний, которые влияют на здоровье человека глобально1. Три наиболее важных родов комаров, влияющих на здоровье человека являются Aedes, малярийные комары и Culex. Видов комаров Aedes вектор арбовирусов, которые вызывают Зика, денге, желтой лихорадки и чикунгуньей. Видов Anopheles вектор малярийных паразитов и Culex видов передавать вирус Западного Нила и филярий нематод2. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) вызываемый 20203 для искоренения из десяти забытых тропических болезней (НТД) и определили комарами как наиболее жизнеспособной стратегии. Инсектицидов являются мощными инструментами для уничтожения комаров и для уменьшения болезни передачи4,5. Однако появление инсектицидами устойчивостью комаров населения угрожает продолжение контроля за многих заболеваний6,,7–8. Инновационные векторного управления консорциума (ИКБП) запустила первый целенаправленные усилия для разработки замены инсектицидов для комаров управления9. Новые инсектициды с роман видов действий (MoA) необходимы для целей ВОЗ и достижения контроля заболеваний. Открытие и разработка новых классов инсектицидов с Роман Моа требуют весь организм анализов для быстрой и высок объём анализа химия и по сравнению с отрасли стандартов10.
Несколько анализов доступны для оценки отталкивающих свойств и токсичность инсектицидов личинок и взрослых комаров, и некоторые из них подходят для оценки романа сформулированы или unformulated химия. ВОЗ протокол11 относится контакт используется для тестирования продуктов против четвертого instar личинки. Опубликованные исследования также описывают разнообразные личиночной анализов используется для проверки на токсичность малые молекулы химия для личинки Aedes aegypti, Anopheles gambiae и Culex quinquefasciatus10,12, 13,14,,1516. Центры по контролю над заболеваниями и профилактике (CDC) бутылка биопроб используется для оценки резистентности к инсектицидам, в поле поймали популяции взрослых комаров через оценку летальная концентрация (LC) и смертоносных время (LT) по сравнению с стандартный диагностический доза в коммерческих инсектицидов17. Испытание восприимчивости ВОЗ предлагает другой подход к оценке инсектицидам в взрослых комаров, whereby комаров подвержены инсектицидом бумаги внутри стеклянных флаконов для 1 h и смертности оценивается в 24 h18. Другие анализы распыления составов внутри закрытой клетки и запись комаров сногсшибательно и смерть желаемого timepoints19. Нанесение на грудную клетку комаров был использован для оценки потенции различных пестицидов20. Создание тестирования насекомых Ливерпуль (LITE)21 использует стандартные оперативные процедурыдля оценки отпорности химия для взрослых комаров. LITE взрослых актуальные assay применяется небольшой объем тестирования продукта к грудной клетки взрослых комаров с смертности, забил на 48 ч. Assay позволяет количественной оценки дозы, полученной на отдельных комаров21. LITE преплюсневой оценивает токсичности тест продукта для взрослых комаров, опираясь на химически обработанную поверхность и используется для идентификации химия с потенциалом развития как крытый остаточного спреи (IRS) или использовать в инсектицидами противомоскитных сеток (ОИС) для управления малярийных комаров.
ВОЗ и CDC анализов имеют ограничения для тестирования роман, unformulated химия, и CDC бутылка биопроб цель оценки восприимчивости за короткий пробирного периодов (два часа) вместо токсичности22,23. Кроме того анализы для оценки токсичности химия в крови еды и потенциал для развития продуктов системного действия (например, endectocides) отсутствуют. Здесь мы описываем анализов для проверки активности mosquitocidal Роман химия, которые растворяются в воде или один из нескольких органических растворителей против личинок и взрослых Aedes, малярийные комары и Culex. Во-первых, мы демонстрируем личиночной пробирного ранее описанные в нашей группе10,12,13,16и здесь выступали как (1) доза экрана быстро оценить несколько химия в одной точке, и (2) ответ пробирного дозы для определения летальная концентрация (например, LC50, LC75 или90,LC) одного химии. Далее мы опишем два взрослых анализов для определения летальной дозы (LD). Первым из них является адаптация LITE протокол для тестирования злободневно прикладной, Роман химия против взрослых комаров по сравнению с позитивного управления. Во-вторых, кормления assay для оценки химия, системно доставлены через крови еды.
Инсектицидов являются мощными инструментами для борьбы с комарами заболеваниями как малярия25, денге и Зика26. Обширные Инсектицид использования выпустила популяций комаров, что устойчивы к химическому элементу управления, ведущих к развитию резистентности к инсектицидам, который считается единственной крупнейшей угрозой продолжение заболеваниями. Последнее десятилетие было отмечено резкое увеличение популяций Anopheles spp. устойчив к синтетических пиретроидов (SPs) используется в сеток в Африке7. Популяций Aedes albopictus, вектор денге и Зика, были зарегистрированы в Флорида и Нью-Джерси, которые устойчивы к органофосфатов6. Аналогичным образом устойчивость к ДДТ и пиретроидам задокументировано в популяциях Anopheles и Aedes spp. в Колумбии27,28. Существует настоятельная необходимость разработать новые ларвициды и особями, которые связывают различные orthosteric или аллостерический сайты по известным молекулярным мишеням или нарушить новые цели (т.е., Роман MoA химия)29,30 и у минимального воздействия на окружающую среду. Растет также признание потенциала вокруг endectocides для комаров управления31,32,33.
Чтобы облегчить быстрое развитие таких продуктов, мы описывают последовательность протоколов, предназначенных для оценки токсичности малые молекулы химия личинки комаров и взрослых по двум маршрутам доставки – контакт и употребления. Протоколы, такие как тест восприимчивости ВОЗ и пробирного бутылка CDC в общем используются для оценки токсичности и отталкивающих свойств существующих инсектицидные составы1,2. Однако эти анализы имеют ограничения для анализа unformulated Роман химических образований (NCEs) и не поддаются тестирования большого числа химия в средней или высокой пропускной способности.
Здесь мы опишем стандартный личиночной пробирного быстро оценить NCEs в дозе одной точки, которую можно масштабировать для высокой пропускной способности анализа. Мы также обсудим адаптацию разработанной LITE21 для оценки контактной токсичность малые молекулы химия для взрослых комаров assay. Наконец мы опишем заглатывания assay для оценки токсичности NCEs доставлены через еды крови взрослых женщин комаров и исследовать потенциал endectocide. Эти личинок и взрослых анализов могут быть выполнены в диапазоне доз для того, чтобы определить значения LC и LD, соответственно, и личинок и взрослых контакт анализов могут быть выполнены по сравнению с одной или более существующих химических составов. Взрослый актуальные assay также позволяет расчет значений LD на отдельных Москито. Протоколы могут быть выполнены с использованием вида Aedes, малярийные комары и Culex16,29 и может быть изменена с учетом специфики биологических видов, при желании. По нашему опыту mosquitocidal химия обычно демонстрируют широкую активность через эти три родов16,29, но есть значение оценки видов селективности.
Анализы являются отправной точкой для быстро экран несколько химия для инсектицидное действие. Химия, которые проявляют токсичность в один или несколько анализов может быть выбран для дальнейшего анализа через вторичных и третичных анализов. Примеры включают LITE преплюсневой пробирного и сахар, кормления анализов34,35. Обычно выбор дополнительных анализов определяется соображениями вокруг предполагаемого рынка и приложение, с результатами, обеспечивая понимание режимы доставки продукта. В представительных результаты, показанные здесь мы исследуем токсичность амитриптилин, антагонист беспозвоночных и млекопитающих дофаминовых рецепторов, который был оценен потенциал как Роман MoA инсектицидами10,12, 13 , 16. Амитриптилин выставлены токсичности для личинок и взрослых А.е. aegytpi мкг предлагая диапазон борьбе и adulticidal активности и обоснованием изучение химических серии Амитриптилин для идентификации аналогов с высокой потенции. В А.е. aegypti подвержены Амитриптилин в крови еды было отмечено статистически значимого влияния на смертность или плодовитость. Хотя стабильность химии в дефибринированной крови и эффективной дозы, полученной за комаров не известно, существенных ограничений assay, данные показывают, что Амитриптилин и других GPCR-активных соединений могут иметь мало потенциал как endectocides, в крайней мере в unformulated состояние.
Важное значение имеют меры предосторожности для ограничения биологические различия между анализов. Все анализы должны выполняться при стандартных условиях температуры и влажности, предпочтительно в камере роста насекомых, с тем чтобы обеспечить воспроизводимость. Крайне важно, чтобы стандартизировать процедуры забил фенотипические конечные точки, как они могут быть весьма субъективным, ведущих к значительные вариации в данных Записанная персоналом различных лабораторных. Личинок assay лучше всего подходит для оценки химия, которые растворимы в воде, хотя assay может производиться с использованием органических растворителей, таких как ДМСО, условии, что окончательное концентрация составляет менее 1% хорошо. Мы признаем несколько ограничений для взрослых актуальные assay. Во-первых это необходимо для работы быстро при подготовке серийных разведений и доставку дозы как перевозчик (ацетон) является крайне неустойчивым и испарения может производить изменения в размере химии доставлены. Во-вторых следует позаботиться о том, для ограничения периода анестезии, поскольку это может способствовать смертности. Следует также отметить, что растворители, как ацетон может производить быстрый эффект «нокдаун» в первые несколько часов тематического анализа, который не следует путать с эффектами из-за тестирования химии. Мы отмечаем, что объем еды крови комаров колеблется между людьми, осложняет оценку дозы, полученной на взрослого в assay взрослых при приеме внутрь. Наконец анализа данных не следует рассматривать в тех случаях, когда смертность в отрицательный контроль превышает 10%.
Продукты, которые действуют синергически все шире признаются для их потенциал для расширения полезности существующих продуктов и обеспечения контроля вредителей инсектициды устойчивых популяций15,16,36. Личиночной анализов были использованы для изучения синергизма между formamidine пестицидов, амитраз и разнообразные химия, которые нарушают беспозвоночных октопамин рецепторов14,15. Личинок пробирного и взрослых актуальные assay описал подходят для оценки синергического или аддитивные эффекты между комбинаций тестовых химия. Мы отмечаем, что синергисты например пиперонилбутоксид (PBO) могут быть включены в каждый из трех анализов, описанных здесь.
Описанные выше анализов обеспечивают стандартизированные экспериментальной серии для оценки unformulated, малые молекулы препаратов против водных и наземных москитной жизни этапы. Эти анализы предназначены специально для оценки токсичности и предлагают несколько преимуществ над существующими assays общего использования. Важно отметить, что анализы поддаются автоматизации и может быть выполнена в промышленных масштабах для включения оценки тысячи испытаний соединений. Наконец, как поле считает развитие продуктов, которые действуют через новый Моа, в том числе через нарушение Роман молекулярным мишеням и биохимические пути, будет необходимо набрать несколько фенотипических конечных точек в дополнение к тем, таких, как смертность и паралич. Выше анализы позволяют такие расследования, обеспечивая тем самым шаг к инновационным инсектицидные технологии завтрашнего.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят H. Ranson, Ливерпуль школа тропической медицины для помощи с развитием пробирного и положение протокола, LITE, и м. шарф, Университет Purdue для консультаций относительно пробирного дизайн.
Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | – | Tool needed for topical application experiments |
24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | – |
Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | – | Used to seal the paper cups |
Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
Tulle fabric, white | Walmart | – | – |
Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | – | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
Tweezers (fine) | Fontax | – | Used to handle adult mosquitoes |