모기에 소설 Insecticidal 화학 물질의 독성을 테스트 하기 위한 프로토콜

참고: 다음 프로토콜에서 설명 하는 모든 긴장 및 작업에 필요한 시 약 및 공급 업체는 자료의 테이블에에서 나열 됩니다. 1. 문화 모기의 애벌레와 성인 참고: 살충제 취약 변종 모기의 말라리아 연구 및 시 약 참조 저장소에서 사용할 수 있습니다. 종자는 다음과 같이 권장: Aedes aegypti 리버풀 (LVP) 스트레인, Anopheles gambiae 키 수 무 (KISUMU1) 긴장과 Culex quinquefasciatus 요하네스버그 (JHB) 스트레인. 12 h 주/12 h 밤에 계란에서 문화 모기 애벌레 25 c m x 40 c m 플라스틱 쟁반에 28 ° C와 75 ~ 85% 상대 습도 (RH)에 주기 (~ 400 애벌레 트레이 당) Nuss29에 의해 설명 된 대로. 피드 애벌레 지상 햄스터 (A. aegypti 및 An. gambiae) 또는 플레이크 물고기 음식 (C. quinquefasciatus). 애벌레의 분석에 대 한 세 번째 애벌레 (L3) 탈피 단계에서 애벌레를 수집 합니다. 위에서 설명한 조건 하에서 insectary에서 20 L 플라스틱 케이지 내부 플라스틱 컵을 전송 pupae에서 성인 모기 후면. 29설명 되어 있는 대로 20% 설탕 해결책에서 모기를 유지 합니다. 3-5 일 포스트 출현에서 성인 수집 합니다. 2. 애벌레 연락처 분석 결과 (단일 지점 복용량 또는 복용량 응답 분석 결과) 참고: 분석 결과 테스트 웰 스에서 DMSO의 최종 농도 1%를 초과 하지 않는 화학 물 또는 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 용 해는 함께 수행할 수 있습니다. 대체 용 매는 옵션을 수 있습니다 하지만 그것은 72 h 게시물 노출에서 10% 사망률 보다 더 먼저 최종 농도 발생 하지 않습니다 확인 필수. 단일 지점 복용량 또는 복용량 응답 분석 결과 분석 결과 수행할 수 있습니다. 후자를 수행 하는 경우 것이 좋습니다 농도 (5 최소)의 범위를 테스트를 걸친 예상된 LC50. 그림 1에서 보듯이 분명 24 잘 조직 격판덮개의 우물을 레이블을 지정 합니다. 1.5 mL 튜브에 테스트 화학의 재고 솔루션을 준비 합니다. 각 화학 분석 균형을 사용 하 여 무게 및 용 해도 특성에 따라 살 균 ddH2O, DMSO 또는 선택의 다른 적당 한 유기 용 매에서 중단 다시 ( 그림 2참조).참고: 계산 한다 고려 화학의 순도. 예를 들어 99% 순수 화학에 대 한 1%의 솔루션을 얻기 위해 아세톤의 1000 µ L에서 10.1 mg을 디졸브. 파라핀 필름으로 밀봉 하 고-20 ° c.에 저장 평가 되 고 적절 한 용 매를 사용 하 여 재고 솔루션에서 직렬 희석에 따라 준비 테스트 화학의 최종 농도 결정 합니다.참고: 농도 용 매와 화학의 볼륨 산출 될 수 있다 공식 C1을 사용 하 여 * V1= C2* V2 를 C1샘플 1, C2의 농도 = 샘플 2, V1의 농도 = =의 볼륨 1와 V2= 샘플 2의 볼륨. 그림 2 및 표 1에 표시 된 예에서는 계산을 참조 하십시오. 원하는 테스트 농도 (표 1B)를 얻기 위해 필요한 10 m m 재고 솔루션 및 직렬 희석을 준비 합니다. 조직 문화 테스트 플레이트;의 우물 5 L3 애벌레 전송 넓은 구멍 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여, L3 유 충은 길이 의해 인식 될 수 있다 (~ 2.5-3.5 m m)와 머리 캡슐의 폭 ~ 0.025 m m24. 부드럽게 1 mL 피 펫으로 물을 제거 하 고 ddH2O의 원하는 볼륨 (아래 참조)으로 바꿉니다. N를 반복 처리 (즉, 20 치료 당 총 애벌레) 당 4 기술 복제를 =. 24 잘 테스트 플레이트에 4 개의 복제 우물의 각 테스트 화학의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 화학의 균일 한 혼합 되도록 접시 소용돌이. 일정 조건 하에서 테스트 또는 성장 챔버에 접시를 놓고 (예를 들어, 25 ° C와 ~ 75-85 %RH 것이 좋습니다, 그리고 어두운 12 h 빛/12 h 주기 가능한 경우).참고: 재현성 실험 사이,에 대 한 후속 분석 같은 환경 조건 하에서 수행 됩니다 확인 합니다. 30 분, 1, 각 잘에서 죽은/무응답 애벌레의 수를 기록 1.5, 2, 3, 24, 48 및 72 h 후 노출 (또는 대체 시간 점) 점수 시트 (표 2). 부드럽게 접시의 측면을 누릅니다. 아무 움직임을 관찰 하는 경우 부드럽게 살 균 이쑤시개와 유 충을 터치 합니다. “죽은” 도청/터치에 응답 하지 않는 애벌레를 점수.참고: 다른 형태학과 행동 고기 관찰 될 수 있습니다 및 기록 될 수 있습니다. 원하는 경우, 다음과 같이 수정 된 애 보트의 수식을 사용 하 여 제어 사망률에 대 한 수정.사망률 (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),여기서 X = 치료 샘플, 그리고 Y % 사망률 컨트롤에서 백분율 사망률 =. 결과 히스토그램 또는 그래프 패드 프리즘 6 또는 이와 유사한, 같은 선택의 소프트웨어를 사용 하 여 로그 곡선 그래프 그리고 컨트롤에 상대적인 치명적인 농도 (LC) 값을 계산. N를 모기의 별도 일괄 처리를 사용 하 여 분석 결과 반복 = 3 또는 더 생물 복제. 3. 성인 국 소 분석 결과 (단일 지점 복용량 또는 복용량 응답 분석 결과) 참고: 성인 국 소 분석 결과 용 매로는 아세톤을 사용 하 여 수행 됩니다. 대체 용 매는 옵션을 수 있습니다 하지만 그것은 먼저 최종 농도 발생 하지 않습니다 확인 필수 48 h 게시물 노출에서 10% 사망률. 단 하나 복용량 또는 복용량 응답 분석 결과 고 치 사 량 (LD)를 결정 하는 데 사용 되는 분석 결과 수행할 수 있습니다. 후자를 수행 하는 경우 것이 좋습니다 농도 (5 최소)의 범위를 테스트를 걸친 예상된 LD50. 분석 결과 완료 하는 데 필요한 성인 여성 모기의 수를 결정 합니다.참고: 단일 화학 포인트 복용량 분석 결과 90 모기 (긍정적인 제어, 아세톤 전용 부정적인 제어를 위한 30 및 30 테스트 화학에 대 한 30)의 최소가 필요 합니다. 5 일 된 성인 여성 모기에 3 문화 고 흡 인기 (그림 3)를 사용 하 여 별도 20 mL 플라스틱 양동이로 이동. 라벨 9 온스 종이 컵과 이름과 테스트 화학의 농도. 10 cm x 10 cm 메쉬 스퀘어와 각 컵에 대 한 고무 밴드를 따로 설정 ( 그림 4참조). (예를 들어, 합성 pyrethroid, bifenthrin) 긍정적인 컨트롤로 기존 살충제를 선택 하 고 아세톤에서 1% 재고 솔루션 (10 µ g / µ L)를 준비.참고: 계산 한다 고려 화학의 순도. 예를 들어 99% 순수 화학에 대 한 1%의 솔루션을 얻기 위해 아세톤의 1000 µ L에서 10.1 mg을 디졸브. 파라핀 필름으로 밀봉 하 고-20 ° c.에 저장 위와 같은 절차를 사용 하 여, 테스트 화학의 재고 솔루션을 준비 합니다.참고: 많은 테스트 화학은 매우 불안 정한, 그리고 솔루션 신선한 생물 검정 수행 됩니다 때마다 만들 수 선호 한다. 긍정적인 통제의 직렬 희석을 준비 하 고 이전 아세톤으로 씻어 서 20 mL 유리 튜브를 사용 하 여 그림 5 와 같이 재고 솔루션에서 화학 테스트. 아세톤과 1 mL 유리 주사기를 제거, 아세톤과와 마이크로-주걱 배달 0.25 µ L의 볼륨 조정에 안전. 일괄 10 일, 3-5 일 오래 된 성인 여성 모기는 흡 인기를 사용 하 여 연습장에서 제거 하 고는 냉장고 나 얼음에 4 ° C에서 최대 5 분 동안 anesthetize. 다음으로, 최대 10 분 동안 얼음에 페 트리 접시를 모기 전송. 신속 하 게 작업, 정밀한 핀셋으로 단일 여성을 제거 하 고 테스트 솔루션의 0.25 µ L 주사기 마이크로-주걱을 사용 하 여 지 느 러 미 가슴에 적용. 각 모기를 해 현미경을 사용 하 여 관찰 하 여 화학의 배달 받는 테스트 화학의 적절 한 볼륨을 확인 합니다. 레이블이 지정 된 종이 컵, 얼음에 모기를 전송 하 고 n를 9 번 반복 = 10 대우 모기. (12 일/12 h 밤 사이클 바람직합니다 h)에 28 ° C와 75 ~ 85 %RH 일정 조건 하에서 플라스틱 욕조 또는 성장 챔버에 전송와 고무 밴드, 보안 메쉬 사각 컵에 모기를 봉인. 두 번 n를 얻으려면 위의 실험을 반복 치료 또는 컨트롤 그룹 당 3 기술 복제 (즉, 30 모기 총) =. 먼저 테스트 화학 그리고 긍정적인 통제와 단계 3.7-3.10을 반복 합니다.참고: 다른 유용한 컨트롤 충분 한 모기를 사용할 수 있는 경우를 포함 하는 테스트 화학 또는 용 매에는 영향을 받지 않는 30 마 취 모기의 “빈”. 30 분, 60 분, 2, 24, 48 h 후 노출 “죽은/무응답” 모기의 수를 기록 (또는 대체 시간 점) 점수 시트 (표 3)을 사용 하 여. 누워 한쪽에 또는 뒤에 비행에 무 능력으로 그들은 이동의 부족을 표시 하는 경우 “죽은/무응답” 정의 된 모기를 점수. 원하는 경우, 다음과 같이 수정 된 애 보트의 수식을 사용 하 여 제어 사망률에 대 한 수정.사망률 (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),여기서 X = 치료 샘플, 그리고 Y % 사망률 컨트롤에서 백분율 사망률 =. 히스토그램 또는 지 수 곡선으로 결과 표시 합니다. 복용량 응답 분석 결과 대 한 LD50, LD75 또는 컨트롤을 기준으로 테스트 화학에 대 한 LD90 값을 계산 합니다. 분석 결과 n를 모기의 별도 일괄 처리를 사용 하 여 두 번 이상 반복 = 3 또는 더 생물 복제. 4. 성인 혈액 공급 분석 결과 (단일 지점 복용량 또는 복용량 응답 분석 결과) 수집 약 150 4-5 일 오래 된 성인 여성 모기 및 별도 케이지를 이전. 복용량 응답 분석 결과 수행 하는 경우 6 감 금 소를 반복 합니다. 설탕 1-24 h 전에 먹이 분석 결과의 소스를 제거 합니다. 화학 (전형적인 재고 솔루션은 물 또는 소금 버퍼에서 80 m m), 순도 대 한 회계, 위에서 설명한 대로 화학의 재고 솔루션을 준비 하 고 그 후 필요에 따라 물/버퍼에 직렬 희석을 준비. 원하는 테스트 농도를 defibrinated 토끼 혈액의 960 µ L를 각는 희석 40 µ L를 추가 합니다. 먹이 장치에 멤브레인 필름을 적용 하 고 고무 반지 물개. 혈액 1 mL 피 펫을 통해 전송 하 고 난방 장치에 먹이 장치를 연결 합니다. 부드럽게 막 표면으로 갓 면봉으로 성인 모기의 10% 젖 산 솔루션 및 장소 먹이 단위를 했다. 검은 천이나 검은 쓰레기 봉지 케이지를 커버 하 고 모기 한 시간에 대 한 피드를 허용 합니다. 테스트 솔루션 및 부정적인 (혈액 전용) 제어의 나머지 부분에 대 한 4.2-4.4 단계 반복 합니다. 먹이의 완료, 모기 anesthetize를 5 분 동안 냉장고에서 4 ° C에서 양동이 배치 합니다. 남성 모기와 여성 모기 먹이 비 제거 하 고 계산 하 고 먹이 부분적으로 복 부의 검사에 의해 모기 먹이의 총 수를 기록. 부분적으로 완전히 먹인된 여성 모기, 복용량 당 50 혈액 먹이 모기의 최소 목표를 유지 합니다. (12 일/12 h 밤 사이클 바람직합니다 h)에 28 ° C와 75 ~ 85 %RH 일정 조건 하에서 플라스틱 욕조 또는 성장 챔버에 양동이 전송. 0.5, 1, 1.5, 2, 24, 48에서 죽은/무응답 모기의 총 수를 기록 하 고 72 h (또는 원하는 대로 다른 시간-점) 점수를 사용 하 여 시트 (표 4). 3 일 게시물 혈액 먹이, 계란 컵으로 소개 하 고 72 h 동안 달걀을 수집. 치료 해 현미경 당 생산 계란의 총 수를 계산 합니다. % 사망률과 통치 각 치료 그룹 및 컨트롤에 대 한 먹이 모기의 총 수의 함수로 계산 합니다. 필요한 경우 수정 된 애 보트의 수식을 사용 하 여 제어 사망률에 대 한 수정. (해당 되는 경우는 복용량 응답 분석 결과 수행) 히스토그램 플롯 또는 지 수 곡선으로 독성과 통치 데이터 표시 선택의 소프트웨어를 사용 하 여. 복용량 응답 분석 결과 수행 하는 경우 LD50, LD75 또는 컨트롤을 기준으로 테스트 화학에 대 한 LD90 값을 계산 합니다. 분석 결과 n를 모기의 별도 일괄 처리를 사용 하 여 두 번 이상 반복 = 3 또는 더 생물 복제.