未熟と大人の蚊殺虫剤、adulticides と endectocides の新しいクラスとして開発のために化学物質の毒性を評価するためのプロトコルを説明します。プロトコルは、高スループットのシングル ポイント線量と線量応答測定接触毒性法や摂取を介して後続の評価で複数の化学のテストを有効にします。
アクションの新規モードで殺虫剤の新しいクラスは、ジカ、デング熱やマラリアなどの病気を送信蚊の殺虫剤抵抗性個体群を制御する必要が。迅速アッセイ、蚊の幼虫と大人に対する新規化合物 unformulated の高スループット分析が掲載されています。単一のポイント線量とジカ、デング熱、黄熱病、マラリア ベクトル、好むと北部のネッタイシマカベクトルに低分子化学物質の毒性を評価するための線量応答の試金のためのプロトコルについて述べる家の蚊、ネッタイイエカ、接触、経口摂取による。例としては、アミトリプチリン、G タンパク質共役受容体の幼虫、大人局所および大人吸血アッセイによる小分子の拮抗薬の毒性を評価します。プロトコルが殺虫剤の可能性を調査するための出発点を提供します。結果は、製品のアプリケーションと配信メカニズムを探索する追加実験のコンテキストで説明します。
蚊の媒介によって世界的に人間の健康に影響を与える伝染病の病原体1。ヒトスジシマカ、ハマダラカ、 アカイエカ人間の健康に影響を与える 3 つの最も重要な蚊属。ヤブカ属のベクトル、ジカ、デング熱、黄熱、チクングニアを引き起こすアルボ ウイルスです。ハマダラカ種ベクトル マラリア原虫とアカイエカ種は西ナイル ウイルスとフィラリア線虫2を送信します。世界保健機関 (WHO) は 2020年3撲滅の 10 無視熱帯病気 (NTD) と呼ばれる、最も実行可能な戦略として蚊コントロールを識別しました。殺虫剤は、蚊を制御し、病気伝達4,5を削減する強力なツールです。ただし、蚊の殺虫剤抵抗性個体群の出現は多く疾患6,7,8の継続的なコントロールを脅かしています。革新的なベクトル制御コンソーシアム (IVCC) は、蚊コントロール9交換用殺虫剤を開発する最初の専用努力を開始しました。アクション (MoA) の新規モードと新しい殺虫剤は、人の目標を達成し、疾病管理を達成するために必要です。発見と小説 2442億と新しい殺虫剤のクラスの開発急速に、高スループットの分析化学と工業規格10と比較して全体の生物の試金が必要です。
新規策定または unformulated の化学的性質の評価が適しているし、複数のアッセイ撥と幼虫、蚊成虫を殺虫剤の毒性を評価することがあります。WHO プロトコル11は 4 齢幼虫に対して製品をテストするために使用接触分析です。発表された研究について述べる様々 な幼虫アッセイネッタイシマカ、に対する、地域のネッタイイエカの10、12,の幼虫に小分子化合物の毒性をテストするために使用13,14,,1516。疾病と予防 (CDC) ボトル バイオアッセイのためセンターを使用して、フィールド キャッチ致死濃度 (LC) と致死時間 (LT の) 診断基準と比較しての評価を介して蚊個体群における殺虫剤抵抗性を評価するには17商業殺虫剤の投与量。WHO の感受性テストという蚊の防虫紙 1 h のガラス瓶の中にさらされているし、死亡率が 24 h18評価蚊の殺虫剤抵抗性を評価する別のアプローチを提供しています。他のアッセイは、必要な縦長19製剤シール ケージとレコード蚊ノックダウンと死の中をスプレーします。蚊胸部へ塗布は20異なる殺虫剤の効力を評価するために使用されています。リバプール昆虫テスト確立 (LITE)21標準の運用手順を採用しています大人の蚊に化学の生物活性を評価します。LITE の大人の局所アッセイは、48 h で獲得した死亡率と蚊成虫の胸部にテスト製品の少量を適用します。アッセイは、個々 の蚊21あたりの受信量の数量化できます。LITE 瞼試金テスト製品を化学的に扱われた表面で休む大人の蚊の毒性を評価し、屋内残留噴霧 (IRS) として開発のための潜在性の化学物質を特定したり、殺虫剤処理蚊帳 (ITNs) で使用するために使用ハマダラカ蚊を制御します。
WHO、CDC の試金は小説、unformulated の化学のテストに限界があるし、CDC ボトル バイオアッセイの目標は毒性22,23ではなく、短い測定期間 (2 時間) にわたって感受性の評価。さらに、化学物質の毒性を評価するための試金は血食事で配信し、全身機能製品の開発の潜在的な (すなわちendectocides) が不足しています。ここでは、水や幼虫に対するいくつかの有機溶剤の一つとしアカイエカヒトスジシマカ、ハマダラカの大人で溶ける新規化学の mosquitocidal 活動をテストするための試金をについて説明します。以前当社グループ10,12,13,16、によって記述され、ここで実行される幼虫アッセイを示す (1) として単一の時点で複数の化学反応を高速に評価する画面の線量、そして (2) 単一化学の致死濃度 (例えば、 LC50、 LC75または LC90、) 線量応答アッセイ。次に、我々 は致命的な線量 (LD) の定量のための 2 つのアダルト アッセイをについて説明します。これらの最初の肯定的な制御と比較して大人の蚊に対する局所的に適用される、新規の化学のテストのライトのプロトコルの適応です。2 番目の餌全身血液の食事を介して配信の化学的性質の評価用です。
殺虫剤は、25マラリア、デング熱、ジカ26など蚊媒介疾患と戦うための強力なツールです。広範な殺虫剤の使用は、化学的制御に耐性の単一の最大の脅威である殺虫剤の抵抗の開発につながる続けている疾病媒介蚊集団を生産しています。最後の十年は、ハマダラカ属耐性蚊帳アフリカ7で使用されている合成ピレスロイド (SPs) の人口の劇的な増加を見ています。ヒトスジシマカ、デング熱のベクトルとジカ、集団は、フロリダ州、ニュージャージー州有機リン剤6に耐性のある報告されています。同様に、DDT とピレスロイド系殺虫剤への抵抗は、コロンビア27,28ハマダラカ、ヤブカ属の個体数で記載されています。新しい殺虫剤と多様な orthosteric にバインドする adulticides を開発する緊急の必要性があるまたは知られている分子標的のアロステリック サイトが新しいターゲット (すなわち、小説 MoA 化学)29,30を混乱させると環境負荷の少ないがあります。モスキート コントロール31,32,33endectocides の周り潜在的な認識になっています。
このような製品の迅速な開発を容易にするには、一連の蚊幼虫と 2 つの配送ルート – 接触、経口摂取による大人に小分子化合物の毒性を評価するために設計されたプロトコルについて述べる。WHO 感受性テストなど CDC ボトルの試金のプロトコル、共通の毒性と既存殺虫製剤1,2の撥水性を評価するための使用です。しかし、これらの試 unformulated 新しい化学実体 (NCEs) の解析では限界がある、中程度または高スループットで多数の化学のテストに従順ではないです。
ここ高いスループット分析のため、拡張可能な単一ポイント線量の NCEs を高速に評価する標準的な幼虫の試金を記述します。大人の蚊に小分子の化学的性質の接触毒性を評価するライト21によって開発されたアッセイの適応についても述べる。最後に、雌成虫蚊に吸血を介して配信 NCEs の毒性を評価するための摂取法と潜在的な動物用駆虫剤を探索.これらの幼虫及び成虫の試金は、それぞれ、LC、LD の値を決定するために用量の範囲で実行できます、1 つまたは複数の既存化学製剤と比較して幼生及び成体の連絡先アッセイを実行できます。大人の局所アッセイは、個々 蚊あたり LD 値の計算もできます。プロトコルしアカイエカヒトスジシマカ、ハマダラカの16,29の種を使用して実行することができます、必要な場合に、種の特定の生物学的特性に合わせて変更できます。我々 の経験で mosquitocidal の化学的性質は通常これら 3 属16,29の間で広範な活動を展示がある魚種選択性の評価値。
法は、急速に殺虫活性の複数の化学物質をスクリーニングするための開始点です。1 つまたは複数のアッセイで毒性を示すそれらの化学反応は、二次、三次の試金によるさらなる分析の選択でした。LITE 瞼アッセイと砂糖の試金34,35を餌があります。追加試金の選択は、通常製品の配信モードに洞察力を提供する結果と予想される市場とアプリケーションの考慮事項によって決まります。ここに示した代表的な結果ではアミトリプチリン、潜在的な小説 MoA 殺虫剤10,12,として評価されている哺乳類、無脊椎動物のドーパミン受容体の拮抗薬の毒性を探る13,16. アミトリプチリン展示幼虫および大人Ae aegytpiの μ g の範囲を示唆殺虫と成虫の活動とアミトリプチリン ベースの化学シリーズの探査のための理論的根拠を提供する識別するためにへの毒性。高ポーテンシーと類似。Ae。 ネッタイシマカ血食事アミトリプチリンにさらされるは死亡率や産卵数に重大な影響は認められなかった。脱フィブリン血と受信した蚊あたりの実効線量の化学安定性は知られていない、アッセイの顕著な制限データ、アミトリプチリンと他の GPCR 活性物質可能性が示唆された小さな可能性として endectocides で少なくとも、unformulated 状態。
試金の間の生物学的変動を制限する対策が不可欠です。すべてのアッセイは、再現性を確保するために温度、湿度、好ましくは昆虫成長室での標準的な条件の下で行わなければなりません。これらは非常に主観的な別の研究者によって記録されたデータの大幅な変化につながることができる表現型エンドポイントをスコアリングのための手順を標準化することが不可欠です。幼虫のアッセイは、アッセイは、最終濃度がよくあたり 1% 未満、DMSO などの有機溶媒を使用して実行できますが、水溶性で、化学的性質の評価に最適です。大人の局所アッセイにいくつかの制限を認識しています。まず、シリアル希薄を準備するとき、急速に動作する必要があるし、キャリア (アセトン) は揮発性の高い蒸発が生じる化学量変化と用量をもたらします。第二に、これは死亡率に貢献できるよう麻酔の期間を制限するため注意が必要があります。また、アセトンなどの溶剤がテスト化学による効果と混同すべきではない話題のアッセイの最初の数時間で急速な「ノックダウン」効果を作り出すことができる注意する必要があります。我々 は、蚊の吸血量は成人摂取試験で大人 1 名につき受け取った線量の評価を複雑な個人によって異なります注意してください。最後に、測定データを陰性対照の死亡率が 10% を超えた場合に見なすべきでない。
相乗的に動作する製品は、その潜在的な既存製品の有用性を拡張し、殺虫剤抵抗性害虫の人口の15,16,36の制御を提供するますます認識されます。幼虫の試金は formamidine 農薬、amitraz、様々 な無脊椎動物オクトパミン受容体14,15を混乱させる化学間の相乗作用を調べるために使用されています。幼虫のアッセイと説明大人の局所分析テスト化学の組み合わせの間の相乗的あるいは添加物効果の評価に適しています。我々 はここで説明した 3 つの試金のそれぞれに共力剤ピペロニルブトキシド (PBO) などを組み込むことができます注意してください。
上記の試金は水生と陸生の蚊のライフ ステージに対して unformulated、小分子薬の評価に関する標準化された実験的なシリーズを提供します。これらのアッセイは、毒性を評価し、共通の使用を試金する既存の上のいくつかの利点を提供する設計します。重要なは、法はオートメーションに適しているし、テスト混合物の何千もの評価を有効にする工業的規模で実行できます。最後に、フィールドは、新しい 2442億を介して動作する製品の開発を検討、新たな分子標的と生化学的経路の混乱など不可欠になります以外死亡率など複数の表現型エンドポイントを獲得して麻痺。上記の試金は、このように明日の革新的な殺虫技術に向けてのステップを提供する、このような調査を許可します。
The authors have nothing to disclose.
著者 H. ランソン、分析法の開発と LITE の議定書のいかなる規定についてリバプール熱帯医学校に感謝し、m ・ シャーフ、パデュー大学のアッセイに関する助言のためのデザインします。
Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | – | Tool needed for topical application experiments |
24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | – |
Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | – | Used to seal the paper cups |
Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
Tulle fabric, white | Walmart | – | – |
Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | – | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
Tweezers (fine) | Fontax | – | Used to handle adult mosquitoes |