JoVE Journal > Chemistry
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
化学

הכנת סיליקה פונקציונלי באמצעות שיטת Bioinspired

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57730
, ,
1Department of Chemical and Biological Engineering,University of Sheffield

概要

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסנתז חומרים סיליקה bioinspired, לשתק אנזימים המצוי בו. סיליקה הוא מסונתז על ידי שילוב של סודיום סיליקט, אמין ‘תוספת’, אשר מנטרלים בקצב מבוקר. ניתן לשנות תכונות של חומר ותפקוד בחיי עיר אנזים הנייח או פוסט-סינתטי • חומצה תנאי של תוספים שעברו אנקפסולציה.

Abstract

המטרה של הפרוטוקולים המתוארים בזאת היא לסנתז חומרים סיליקה bioinspired לבצע אנקפסולציה אנזים המצוי בו, חלקית או לחלוטין לטהר אותו על ידי חומצה • תנאי. על ידי שילוב של נתרן יחד עם bioinspired polyfunctional מוספים, סיליקה נוצר במהירות על תנאי הסביבה על ניטרול.

ההשפעה של ניטרול biomolecule וקצב תוספת נקודה על התשואה סיליקה נחקרות, biomolecule בטקטיקות יעילות מדווח לשם שינוי תוספת נקודה. בניגוד לשיטות אחרות סינתזה סיליקה נקבובי, הוא הראה כי מתון התנאים הנדרשים לקיום סינתזה סיליקה bioinspired הם תואמים באופן מלא ומגעים מולקולות עדין. בנוסף, תנאי מזג אוויר מתונים משמשים לאורך כל השלבים סינתזה ושינויים, שהופך את סיליקה bioinspired מטרה מבטיח הסולם ואת המסחור בתור חומר חשוף והן תמיכה פעילה בינונית.

הסינתזה מוצג להיות רגישה מאוד לתנאים, קרי, שער הניטרול ו pH סינתזה הסופי, עם זאת חזק שליטה על פרמטרים אלה הוכח באמצעות שיטות טיטור אוטומטי, שמוביל הפארמצבטית גבוהה ב מסלול התקדמות התגובה ועם תשואה.

לכן, bioinspired סיליקה הוא בחירה מצוינת תמיכה חומרים פעילים, מציג צדדיות כלפי רבים היישומים הנוכחי, לא רק את אלה הפגינו כאן, ואת העוצמה ביישומים עתידיים.

Introduction

השימוש של סיליקה כתמיכה מבנית עבור זרזים תעשייתי מעוגנת היטב, ומאפשר פעילות זרז משופרת, יציבות ו processability,1 ומכאן פוטנציאל להפחית את עלות התפעול. יתרונות אלה הם לפי חודשים במקרה של אנזים הנייח, כמו אחסון בתוך מערכת נקבובית סיליקה יכול להתייעץ על משך החיים של אנזים יתרונות משמעותיים על פני מקבילתה חינם. בהתאם לכך, יש כבר שהושקעו מאמץ רב במציאת השיטה הטובה ביותר כדי לצרף אנזימים סיליקה מינים, עם סקירות מרובות השוואת חקירות באמצעות שיטות שונות של קיבעון על siliceous תומך מוצק. 2 , 3 , 4

אנזימים מחוברים בדרך כלל באמצעות physisorption או מליטה קוולנטיות, בנוסף אנקפסולציה בתוך חומר נקבובי. 5 . עם זאת, ישנם חסרונות משמעותיים הקשורים לכל שיטה: physisorption מסתמך על אינטראקציות משטח ארעי בין סיליקה biomolecule, אשר יכול בקלות להיות נחלש התנאים התגובה שמוביל לא מקובל אנזים שטיפת. הקובץ המצורף קוולנטיות חזק יותר בדרך כלל גורמת בפעילות נמוכה בשל החופש הסתגלותי מופחתת של המין פעילים. עיטוף עלול לגרום פעילות מופחתת עקב הנגישות אנזים או מגבלות diffusional. 6

ההתפתחויות האחרונות בתחום של syntheses מתון יותר של סיליקה (לעיתים קרובות שכונתה ‘ bioinspired’) הקימו את בחיי עיר ומגעים מולקולות ומינים אחרים פעיל במהלך הסינתזה גשמי. 7 , 8 , 9 שיטה זו שוללת רבים החסרונות של קיבעון קונבנציונלי – בניגוד chemisorption גישות הסתגלותי חופש biomolecule נשמר על ידי השימוש של אינטראקציות noncovalent חלש יותר אבל כטפסים חלל הנקבוביות מסביב biomolecule, שטיפת עדיין נמנעת. אכן, כימוס הוכח לעבוד עבור מגוון של מולקולות ותאים אפילו כל,10 , דרך כימוס bioinspired סיליקה אפקטים כגון הביטול עקב תהליך קשה יכול להימנע תנאים. 7 , 11

מטרת השיטה המתוארת כאן היא להכין סיליקה נקבובי עם מאפייני לשליטה, תחת תנאי הסביבה, באמצעות תוסף אורגני bioinspired. השיטה ניתן לשנות בקלות כדי לכלול ומגעים מולקולות או אי-ובנוסף, להיות מוצג מבחר של אשר. אנו מראים עוד שיטה נתיישב שינוי החומרים כמו-מליפאזות כדי להשיג טיהור ולמאפיינים בצובר הרצוי על-ידי הסרת התבנית אורגני דרך • תנאי חומצה.

בהשוואה הסינתזה המסורתי של סיליקה נקבובי בתבניות תומך (כגון:סיליקה חומרים בתבניות באמצעות חומרים פעילי שטח סופרא מולקולרית הרכבות מלמ ק-41 או SBA-15)12 שיטה זו היא משמעותית מהר יותר, מתון יותר, המאפשר מותאם, כימוס בחיי עיר ללא צורך הנייח הפעולות הרבות טיהור מפרך. יתר על כן, השימוש • תנאי חומצה ולא calcination פותח את האפשרות של functionalization משטח אורגני.

שיטה זו ישימה במיוחד לאלה עובד הנייח מינים הפעילים אשר מצאו physisorption או הנייח קוולנטיות יהיו אפקטיביים. . זה גם שימושי עבור אלה בחקר תהליך הסולם כפי הסינתזה bioinspired ממוקם באופן ייחודי עבור לתיעוש לעומת חומרים סיליקה בתבניות קונבנציונלי. 13 , 14 שיטה זו אינה מומלצת עבור יישומים הדורשים מערך מסודר של הנקבוביות בתוך גשמי , למשלעבור פוטוניקה, כמו מבנה גשמי הוא מגרה למרות כל הדמיון במאפייני בצובר.

Protocol

1. הכנת קודמן פתרונות (ופתרונות Encapsulant אופציונלי) לתוך מיכל פלסטיק 180 מ”ל, למדוד 1.5 mmol של סודיום סיליקט pentahydrate (318.2-מ ג), להמיס 20 מיליליטר מים יונים. באופן דומה, במיכל השני, למדוד mmol 0.25 של pentaethylene hexamine (PEHA, 58.1 mg), להמיס 20 מיליליטר מים יונים. בעת שימוש חלופי amine המכילים תרכובות , למשלdiethylenetriamine (DETA) או triethylenetetraamine (תטא), להבטיח כי היחס שומה הכולל Si:N נשאר קבוע-1 (קרי, המתאים mmol 0.5 של DETA או mmol 0.375 של טאטא ב ההליך המתואר)15. בעת שימוש amine פולימריים ותוספים , למשלpoly(ethyleneimine) (פיי) או poly(allylamine hydrochloride) (הפה), לשמור על ריכוז של 1 מ”ג/מ”ל (התגובה האחרונה נפח)15.התראה: להתמודד עם אלה אמינים רק בתוך ברדס fume, כפי שהם מאכל או רעילים בצורות טהור שלהם (במיוחד כמו האדים). כדי לבצע אנקפסולציה בחיי עיר במהלך הסינתזה, להמיס מסה שנקבע מראש של חלבון (בזאת 50 מ”ג של שור אלבומין, BSA) ב 5 מ ל מים יונים. הפחת את כמות המים של נפח המים יונים שישמש עבור פירוק pentahydrate סודיום סיליקט. כדי להקל על פירוק חלבונים מבלי לשנות את המבנה שלו, פעם מעורבב עם מים יונים, קאפ המכולה ולאחסן ב 4 º C. בדוק מדי פעם על התפרקות ההתקדמות, רצוי ללא ערבוב. 2. סיליקה סינתזה לשלב את הפתרונות של pentahydrate סודיום סיליקט, PEHA אחד של המיכל 180 מ”ל ולהוסיף מים יונים כדי להפוך את הגמר פתרון אחסון 41 מ”ל (או 46 אם מושמט בחיי עיר כימוס). מניחים את התערובת טריות של סודיום סיליקט ופתרונות PEHA על צלחת קדירות, הוספת בר קדירות לספק ערבוב עקבית. לתוך כלי השיט הזה, להשעות בדיקה pH והקלטה של ה-pH ההתחלתית. בשלב זה, באופן אופציונלי, להסיר את aliquot µL 750 של תערובת המוצא לקביעת מאוחר יותר הריכוז [סי] הראשונית באמצעות וזמינותו spectrophotometric מוליבדן כחול, כפי שמתואר בשלב 8.1. להתחיל את הסינתזה על-ידי הוספת כמות קבועה מראש של 1 M HCl, כפי שמחושבת איור1, ולבחון את האבולוציה מיידית של עכירות (ראה איור 2) ברגע תוספת חומצה נגמר, להוסיף את הפתרון encapsulant (אם בכלל) מהר ככל האפשר.הערה: הכרך האחרון בהתחשב בכמויות האלה הוא 50 מ של תערובת התגובה הכולל, המוביל אל סי ו- N ריכוזים של 30 מ מ. זה וניתן לשנותם לפי הצורך על-ידי הכפלת כמויות מעל סכום קבוע. להקליט את ה-pH לאחר 5 דקות כדי לקבוע את השלמת התגובה; ודא כי ה-pH 7 ± 0.05. 3. • תנאי חומצה של החומרים לשנות את ההרכב של סיליקה המיוצר לאחר התגובה הגיעה השלמה (גם בתור של coagulum כמו תוצרת או על-ידי resuspending מדגם מסונתז הקודם של סיליקה) על ידי התוספת של חומצה נוספת. אם resuspending סיליקה, לערבב כ 150 מ”ג bioinspired איך מכינים סיליקה עם 100 מ של מים יונים בתוך מיכל פלסטיק 180 מ”ל, מניחים על צלחת בחישה. ברגע התליה הוא טוב מעורב, להשעות בדיקה pH בתוך הכלי. Titrate ב- HCl נוספת עד רמת ה-pH הרצוי (בין 7 ו- 2) הגיעה ולאפשר לייצב עבור ca. 1 דקות. חכה עוד 5 דקות כדי להבטיח המערכת יש מלא equilibrated, ולאחר מכן המשך כדי לבודד את סיליקה מוצק. 4. סיליקה ההפרדה וייבוש Decant המתלה סיליקה bioinspired לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מ. Centrifuge את המתלים ב 5000 g למשך 15 דקות. הסר את תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה וחנות לצורך ניתוח נוסף (למשל, ברדפורד assay, ראה להלן). למלא את צינורות צנטריפוגה עם מים יונים, מחדש להשעות את סיליקה באמצעות מערבל מערבולת. חזור צנטריפוגה, אחסון supernatant, re-השעיה פעמיים. לאחר צנטריפוגה סופית, להסיר את תגובת שיקוע, לגרד את סיליקה לתוך כור קרמיקה. יבש בתנור למשך הלילה ב 85 מעלות צלזיוס. אם כימוס התרחש, להשתמש במתקן להקפיא ייבוש או תנור פועל תחת ואקום כדי למנוע דנטורציה של חלבונים. 5. ייצור של מוליבדן כחול ריאגנט (ראשית MBR) לקביעת [סי] אל בקבוק פלסטיק נפח 1 ליטר, להוסיף 8 mmol (10 גרם) אמוניום molybdate tetrahydrate בארון fume. להמיס זה יונים 500 מ”ל מים תחת ערבוב. Acidify את הפתרון על-ידי הוספת בקפידה 60 מ של פתרון HCl 10 מ’. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ל’ 6. הפקת פארא-aminophenol סולפט צמצום הסוכן (RA) לקביעת [סי] המקום 500 מ ל זכוכית סטריליות באמבט מים בטמפרטורת הסביבה על צלחת קדירות בארון-fume. הוסף mmol 111 (10 גרם) של חומצה אוקסלית נטול מים, 19.5 mmol (3.35 g) פארא-aminophenol סולפט, 16 mmol (2g) של נתרן sulfite, להתמוסס במים 250 מ. לאט ובזהירות להוסיף 92 g (50 מ”ל) של חומצה גופרתית רווי תוך כדי ערבוב ולחכות לתמיסה להתקרר. לבסוף, לדלל עד 500 מ”ל מים יונים. 7. Silicomolybdic חומצה Assay על מינים סיליקה Monomeric בקבוקון פלסטיק 5 מ”ל, מיוצר שתדללו 300 µL של ה-MBR בשלב 5.4 עם 3 מ ל מים יונים. להוסיף 10 µL של פתרון מבחן silicic ו- shake לערבב.הערה: פתרון זה לאט יהפוך צהוב. לאחר 15 דקות בדיוק, להוסיף 1.6 מ של הסוכן צמצום מקריסטלים של סעיף 6 כדי לצמצם את silicomolybdate צהוב מורכב איזומר הכחול שלה. לאפשר צבע כחול לפתח לפחות 2, אך לא יותר מ 24 שעות. למדוד את ספיגת מדגם-810 ננומטר בספקטרופוטומטר UV-vis ולחשב [סי] נגד עקומת כיול. 8. Silico Molybdic Assay חומצה על מינים סיליקה פולימריים כדי למדוד את ריכוז מינים polysilicate באמצעות שיטת מוליבדן כחול, צינור microcentrifuge, משלבים µL 750 של תמיסת נתרן הידרוקסידי 2 מ’ עם 750 ההשעיה סיליקה µL. חותם, במקום לצוף microcentrifuge. ודא קראוון מספיק שנשאר בצינור כדי למנוע מתפרצת עקב הצטברות הלחץ.הערה: קראוון של 500 µL מספיקה בדרך כלל למנוע זאת. לחלופין, ההליך יכול להתבצע בבקבוקונים פתוח כל עוד אובדן נוזלים עקב התאדות מהצהוב. לצוף הצינורות microcentrifuge באמבט מים מחומם עד 80 ° C ולהשאיר את זה כדי להמיס לשעה. אחרי 1 h חלף, להסיר את הצינורות microcentrifuge, לנגב את יבש בחוץ. ברגע מקורר, [סי] יכול להיקבע כמתואר לעיל כמתואר בצעדים 7.2 ל 7.5. 9. ברדפורד Assay נוהל קביעת ריכוז חלבון בסיליקה להוסיף סכום קבוע מראש (טמפרטורת החדר) ברדפורד ריאגנט ודגימת cuvette המוקצות לכל (ראה טבלה 1 ו- 2 בטבלה עבור אמצעי אחסון מסוים). השתמש בעצות פיפטה חד פעמיות עבור כל cuvette כדי למנוע שינוי עוצמת הקול בשל אופיו הכימית וחזור בכל נקודה דולר. לערבב את כל cuvette על ידי היפוך 3 פעמים ולהשאיר לפתח עבור 10 דקות. למדוד את ספיגת-595 nm באמצעות תגובת שיקוע טהור כמו ריק. לחשב את ספיגת המקורי של כל cuvette על-ידי חיסור של כל אחת מהמידות את ספיגת שנמצאו עבור המדגם שליטה (cuvette מס 0 בשני מבחני). חשב את ריכוז חלבון לדוגמה לא ידוע באמצעות עקומת כיול (איור 3). במקרה של דילול של המדגם המקורי, הגורם דילול צריך להיות אחראים. ליצור עקומת כיול עבור כל ערכה של ניסויים על ידי ספיגת נמדד ההתוויה נגד הריכוז של BSA כדי למנוע תנודות אקראיות העלולות להשפיע על הרגישות של וזמינותו. למרות שיטת זו נועדה לשימוש BSA כסטנדרט לכמת כל סוג של חלבון, ליצור עקומת כיול עבור כל חלבון ספציפי עניין דיוק משופרת. אם תכולת החלבון של המדגם לא ידוע צפוי להיות גבוה מהטווח מקורה של עקומת כיול, למהול אותו לפי הצורך. קובעים חלבון התוכן עבור כל דגימה במהלך re-השעיה לעקוב אחר אובדן חלבון אפשרי.

Representative Results

השיטות המתוארות לעיל מסוגלים בעקביות ובאופן reproducibly לזרז סיליקה. זוהי הקלה ביותר לקבוע על ידי הופעת עכירות בתוך הספינה התגובה, אשר עם הפסקת עצבנות באופן ספונטני להתקבע coagulum עבה של סיליקה זירז (איור 2) מהירה. היקף התגובה ולכן התשואה יכולה להיות מאושרות על ידי מדידת המסה של coagulum זה לאחר ההפרדה, הוא בדרך כלל 58 ± 6.5% (איור 4, צהוב). תובנות חדשות התקדמות התגובה יכול להיווצר על ידי התאמת השיטה ספקטרוסקופיות מוליבדן כחול כדי לזהות את כמות מינים סיליקט monomeric unreacted, כמו גם מינים אלו אשר יש הגיב polysilicates או ‘oligomers’, אבל לא הצליחו להגיע לגודל מספיק והקרשה (איור 4, אדום וכחול בהתאמה). הנתונים היווצרות המינים סיליקה ספציפי הוא עניין מיוחד בעת השוואת יעילות טיטור שונים עבור התגובה משקעים – דהיינו כמה נגיש ה-pH התגובה האחרונה ואת הקצב שבו משפיעה על פלמור של סיליקה monomeric אל ‘אוליגומר’, שלה קרישה הבאים כדי סיליקה מוצק. על ידי שינוי כמות חומצה הוסיף בשלב 2.4 מעט, תחת – או over – titration של תערובת התגובה ניתן לבצע (איור 5). על ידי מדידת את היווצרות המינים סיליקה שוב על שני המקרים האלה, ניתן לראות הבדל ברור בהשלמת התגובה (איור 4) למרות שינויים מינוריים בלבד על הפרופיל טיטור של התגובה (איור 5). למרות הבדל זה קיים בין הצריכה של המינים monomeric המקרים תגובה 3 (הנותרים בין 29-33%), יש הבדל ברור בין מינים סיליקה oligomeric לזרז בכל מקרה ומקרה. . זה מסכים עם התיאוריה המסורתית silicas סול-ג’ל – בפרשת ‘undershoot’ ה-pH מוחזק גבוה יותר, ומאפשר חלקיקים בודדים לגדול, ולכן מסייע קרישה יעיל; במקרה ‘להחטיא’ שהקרישה הנגרמת עקב טיטרציה מהירה הרבה יותר מהר, ולכן פחות של המין סיליקה גדלו לגודל מספיק מצב של קרישת חסר, וחלה בשלב קולואיד. 16 בהתחשב בחשיבות של טיטור על היווצרות סיליקה, ידע אפריורי של אמצעי האחסון המתאים טיטור חיוני. אמנם לא לחילוץ מ התגובה סטויכיומטריה עקב ההתנהגות פרוטונציה מורכבים של תוספים אמין, שינוי חומציות משטח סיליקה על קרישת הדם, ואמינים אמפירי היחסים בין מערכת תוכן, ריכוזים, אמצעי אחסון כייל נוגדנים הם ברצון שנוצר (איור 1). ברגע קרישת הדם הושלמה, משטחים גשמי ניתן בקלות לשנות באמצעות חומצה • תנאי, כפי שדווח לאחרונה על-ידי המחברים במקום אחר. 13 זה מאפשר להתאמות של תכונות חומר כגון קומפוזיציה, נקבוביות, הפעילות הכימית של תוסף (איור 6a ו- b). במחקר זה, BSA שימש אנזים encapsulant המיתר, עם זאת, ניתן להשתמש מהטכניקות שתוארו כאן אנזימים מספר17,18. הנוהל עקב לגילוי חלבון הוא פרוטוקול assay ברדפורד,19 באמצעות את supernatants מאוחסנים של כל מחזור צנטריפוגה. כמות החלבונים ב תגובת שיקוע מחושבת באמצעות עקומת כיול שנוצרו כמויות ידוע של BSA מומס את תגובת שיקוע של מדגם עם אפס תכולת החלבון (שליטה לדוגמה). כמות חלבון מקופל לתוך סיליקה יחושב על ידי חיסור של החלבון שזוהו ב supernatants כמות התחלתית של חלבון נוסף. היחידה הכימית לצורך וזמינותו היא הכימית ברדפורד (רכש או לפי מתכונים רגילים). ישנם שלושה סוגים של תבנית assay, בהתאם האחסון מדגם, הסכום הצפוי של חלבון כדי להתגלות לשיטת המדידה. בזאת, התבנית שהופעלו שצוין עבור ספקטרופוטומטרים, דורש חיטוי רפואי חד פעמי של המאקרו, בגודל מיקרו, ניתן לזהות מ µg 10/מ”ל ל 1.4 מ”ג/מ”ל של חלבון. איור 7 כמות החלבונים זוהה לשטוף אחרי זה (שלב 4.3) מוצג של % מן הסכום הראשוני חלבון (אשר היה 50 מ”ג). בסביבות ~ 50% של BSA זוהה את תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה הראשון, המתייחס הנייח ~ 50% יעילות. כפי שהיה ש-BSA לא זוהה שוטף הבאים, ש-BSA (או כל אנזים אחרים) עלול כימוס באופן מאובטח במהלך סיליקה סינתזה עם אין שטיפת – זה יתרון משמעותי של שיטה זו. על מנת לוודא את הנוכחות של BSA סיליקה המיוצר, בוצע ניתוח פורייה להפוך אינפרא-אדום ספקטרוסקופיה (בעזרת FTIR). הנוכחות של הרצועות האופיינית של אמיד I ו- II באזור של 1,500/cm ו- 1650/ס”מ (איור 8) הדגימות בנוכחות BSA, אבל לא בפקד דגימות (אין BSA) אישר את הנוכחות של BSA המוצקים. בנוסף השיטה של אנזים בנוסף שתוארו לעיל (BSA הוסיף במהלך ניטרול של תערובת התגובה), ישנם אחרים ווריאציות אפשריות כגון:BSA תוספת במהלך ערבוב של סיליקט והפתרונות מוספים, לפני ניטרול או אנזים נוסף לפתרון של סיליקט או כתוסף לפני שלהם ערבוב וניטרול. חלק מהאפשרויות הללו היו בטיולי והיו את היעילות הנייח (מסה של BSA מתאושש אחוז של אנזים נוסף למערכת התגובה, מחושב בהתבסס על וזמינותו ברדפורד) ואת כמות BSA ב סיליקה הסופי (נמדד ריכוז של BSA ב סיליקה כאחוז של המשקל הכולל מורכב המיוצר, ראה איור 9). היה ברור כי כאשר BSA נוספה של ריאגנטים unreacted (מקרים A-C באיור9) היו אין הבדל ניכר בין יעילות הנייח או הסכום של BSA בתוך החומר המרוכב שהתקבל. עם זאת, כאשר BSA נוספת במהלך היווצרות סיליקה (במקרה D באיור9), בטקטיקות יעילות וגם את כמות BSA במוצר הסופי היו שניהם נמוך משמעותית. למרות הבדלים אלה, הסכום הממוצע של סיליקה המיוצר נותר ללא שינוי (בין 85-90 מ ג). תצפיות אלה יכולה להיות מוסברת על בסיס יינון (או נקודה איזואלקטרית) של BSA, סיליקט/סיליקה, את האפס. השיטות השונות של בנוסף לאפשר אינטראקציות שונות בין מבשרי האנזים, סיליקה. כמו ה-pH בזמנו של התוספת של השינויים אנזים, יקבע יינון של כל מין האינטראקציות הבין-מולקולרי, אשר בתורו ישלוט היעילות הנייח. לא cuvette ריכוז של BSA (mg/mL) ריאגנט ברדפורד (mL) לדוגמה (mL) 0 0 (בקרה) 1.5 0.05 1 0.1 1.5 0.05 2 0.25 1.5 0.05 3 0.5 1.5 0.05 4 0.75 1.5 0.05 5 1 1.5 0.05 6 1.25 1.5 0.05 7 דוגמה לא ידועה (X) 1.5 0.05 טבלה 1: מחושב רכיב אחסון הקמה וזמינותו של מאקרו ברדפורד. חוקי עבור קביעת טווח 0.1-1.4mg/mL (אחסון עבור שכפול 1) לא cuvette ריכוז של BSA (ug/mL) ריאגנט ברדפורד (mL) לדוגמה (mL) 0 0 (בקרה) 1 1 1 1 1 1 2 2.5 1 1 3 5 1 1 4 7.5 1 1 5 10 1 1 6 דוגמה לא ידועה (X) 1 1 טבלה 2: מחושב רכיב אחסון הקמה וזמינותו של מיקרו ברדפורד. תקף לקביעת טווח 1-10 µg/mL (אחסון עבור שכפול 1) איור 1 : דרוש נפח כייל נוגדנים כנגד ריכוז סיליקה למערכות תגובה באמצעות DETA או PEHA כמו התוסף. סיליקה היה מסונתז בריכוזים שונים תוך שמירה על [N]: [סי] יחס של 1, עבור שני חומרים כימיים מוספים שונים. קווי שגיאה הן סטיית תקן אחת סביב הממוצע.  איור 2 : תמונות של סיליקה coagulum בתוך הכלי התגובה (א) במהלך ואחרי (ב) עצבנות, הממחיש את עכירות פתרון, ובכלל זה מצביעים על האופטימלית תגובה.   איור 3 : עקומת כיול שיוצרו עבור ברדפורד מאקרו assay. תגובת שיקוע של סינתזה סיליקה bioinspired בהעדר BSA מעורבב עם כמות ידועה של החלבון, ולאחר מכן מתבצע ניתוח ברדפורד כפי שמתואר בשלב 9.1. איור 4 : הברית הפילמור הסופי של סיליקה מינים עבור תנאי ריאקציה שונים. סיליקה הוא מסונתז להשתמש בתנאים אופטימליים (בסיסית), כמו גם עם מעל או מתחת טיטור, אחרי אשר ריכוז סיליקה יחסית לכמת על monomeric או dimeric סידניים (אדום), polysilicate ‘oligomers’ (כחול) ו לקרוש לא יציב סיליקה (צהוב). איור 5 : התקדמות של pH באמצעות מערכת התגובה כפונקציה של נפח כייל הראשונית- חומצה היא מיד עצומות לאחר ca. 38s של ערבוב, גורם ה-pH לרדת במהירות אל מתחת 8. לאחר מכן, עוד כמויות של חומצה באופן אוטומטי במינון כזה כי ה-pH היה 7.0 ± 0.05 300s אחרי תוספת הראשונית. במקרה של יתר titrating, זה לא היה בר השגה, כפי המינון הראשוני היה מספיק כדי להוריד את ה-pH מתחת 7, להגיע pH 6.65 לאחר 300s. נפח HCl הראשונית נוסף עבור ‘undershoot’, ‘בסיסית’, ‘להחטיא’ היה 6.90 7.05, 7.20mL בהתאמה. איור 6 : שינויים במאפייני נציג על לחומצי חומר קרוש סיליקה. (א) שינוי של ריכוז מוספים ביחס pH, (ב) שינוי של סיליקה נקבוביות ביחס pH. לשכפל של מאנינג. et al. 13 תחת רישיון Creative Commons.  איור 7 : BSA ריכוז bioinspired סיליקה סינתזה supernatants. מבחני ברדפורד בוצעו על התגובה supernatants לאחר צנטריפוגה, שממנו החלק היחסי הנותר (ולכן occluded של סיליקה מסונתזת) היה נחוש. איור 8 : ניתוח בעזרת FTIR-סיליקה bioinspired עם ובלי מינים הפעילים כימוס. ספקטרה הראה: שחור קו: קו סיליקה, אפור bioinspired: BSA טהור, הקו הכחול: סיליקה bioinspired עמוסה BSA. אנכי קווים מקווקווים מציינים אמיד האופיינית להקות.  איור 9 : בטקטיקות יעילות ואת מידת BSA ב הפרדות צבע עבור סיליקה המיוצר באמצעות PEHA. BSA נוספה (א) בהפתרון PEHA לפני ערבוב עם סיליקט, (B) בפתרון סיליקט לפני ערבוב עם PEHA, (ג) לאחר ערבוב ראשוני של פתרונות PEHA, סיליקט, ו- (ד) לאחר ערבוב PEHA ו סיליקט פתרונות ונטרול. היעילות נמדדת כמו BSA % אנקפסולציה מעירוב התגובה ביחס BSA סכום נוסף, בעוד BSA ב סיליקה מרמז על % ריכוז של BSA ב סיליקה הסופי מורכב על-ידי המסה. קווי שגיאה הן סטיית תקן אחת סביב הממוצע.

Discussion

העבודה הנוכחית, אנו מציגים שיטה במהירות מאיצים חומרים סיליקה bioinspired, ומגעים מולקולות המצוי בו. נדגים שלבים קריטיים בתוך השגרה, כלומר כמות מתחילה תגובת חומצה שיתווספו, והעיתוי של תוספת של encapsulant biomolecule. אנו מראים את השפעת תוספת חומצה על התקדמות התגובה והן תשואה (איור 4 ו- 5 איור, בהתאמה), הדגימו שיטה שליטה הדוקה על תנאי סינתזה, המאפשרות עקביות למרות רגישות זו. לגבי מינים הפעילים כימוס, למרות ברורה מבחינת ההליך, כימוס מוצג להיות רגישים לתנאי הניסוי (סדר של בנוסף, ה-pH של בנוסף, תנאים סביבתיים), עם זאת, עקביות בחומר מאפייני שוב הוא בר השגה.

ניתן לשנות את התנאים סינתזה באמצעות תוספים שונים, רבים מהם פורסמו במקומות אחרים,15 מתן מגוון מורפולוגיות, porosities. טכניקות נוספות, פוסט-סינתטי כדי לשנות, להתאים מבחינה כימית bioinspired סיליקה חומרים דווחו כגון קישוט amine13 , משטח טיהור מתון. 20 . לבסוף, עקב אופי מתון, מימית של הסינתזה, כימוס בחיי עיר אפשרית למגוון רחב של סובסטרטים מאלה המודגמות כאן, החל אנזימים17,18 תאים שלמים,21 מתכת זלץ,22 חומרים פעילים תרופות,23 וקוונטית נקודות. 24

בניגוד syntheses אחרים-סיליקה אורגנית בתיווך (כגון משפחת מלמ ק-41 או SBA-15 של חומרים), הטבע polyfunctional של bioinspired תוספים לא יכול להפיק הורה נקבובית מבנים, וגם מאוד monodisperse גודל החלקיקים הפצות מאפיין של סיליקה מסוג Stöber. 25 זה זה בגלל חוסר של התנהגות מוגדרים היטב micellization של תוספים (מחוץ במקרים מיוחדים) bioinspired26 משולב עם פעילות קטליטית מוגברת שלהם על תוספים המכילים אמין monofunctional. 26

מצד שני, זה הטבע מוספים polyfunctional מאפשרת את השימוש קצר זמני התגובה, מתון יותר בקרה לעומת אחרים syntheses סיליקה אורגנית בתיווך. זה גם מוביל האפשרות של • מוספים תנאי בטמפרטורת החדר כמתואר לעיל, אשר טרם ניתן להשיג עבור אלה סיליקה משפחות אחרות בשל הפרטים של הכימיה השטח שלהם. 27 , 28 , 29 . כתוצאה מכך, חומרים סיליקה bioinspired הוכחו להיות גם חסכונית יותר וגם מעשיים לייצר ב בקנה מידה גדול, שמוביל מסחור קל ופיתוח. 14

לסיכום, סינתזה סיליקה bioinspired מייצג שיטה מהירה, נתיישב להפקת מינים הפעילים תומך או מדיה sorbent גז. באמצעות שליטה הדוקה pH במהלך ואחרי התגובה, מגוון רחב של סיליקה-אמין ללא הפרדות צבע יכול להיות מסונתז עם תכונות שונות, אשר הוא השלים עוד יותר על ידי האפשרות בחיי עיר הסגירות של מערך של שונות אורגני, חומרים אנאורגניים, או ביו-אורגנית. למרות השינוי שלאחר סינתטי עצמאית bioinspired מוספים וריכוז encapsulant יש עדיין להיות מושגת, שיטות אלה מייצגות צעד מבטיח לקראת לסביבה שפיר תהליכים כימיים.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים תודה התמיכה הכלכלית של המחלקה של כימיקל והנדסה ביולוגית (אונ’ שפילד, אנגליה) EPSRC (EP/L017059/1 ו- EP/P006892/1).

Materials

Silica synthesis
Sodium silicate pentahydrate Fisher scientific 10070470
Pentaethylene hexamine (PEHA) Sigma-Aldrich 292753
Diethylenetriamine (DETA) Sigma-Aldrich D93856 Toxic
Triethylenetetraamine (TETA) Sigma-Aldrich 90460
Poly(ethyleneimine) (PEI) Polysciences 6088 1.2K MW
Poly(allylamine hydrochloride) (PAH) Sigma-Aldrich 283215 17.5k MW
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Hydrochloric acid (HCl) 1M Fisher Scientific 10487830
Silicomolybdic acid assay
Ammonium molybdate tetrahydrate Sigma-Aldrich A7302 Product replaced by M1019
Hydrochloric acid (HCl) 37.0%wt Fluka Analytical 84436
Anhydrous oxalic acid Sigma-Aldrich 75688
Para-aminophenol sulphate Fisher Scientific 10446880
Sodium sulphite Fisher Scientific 10234400
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 84727
Bradford assay
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916
Equipment
Autotitrator Titrando 902 Metrohm 2.902.0010
801 magnetic stirrer plate Metrohm 2.801.0040 For use with above
800 Dosino Metrohm 2.800.0010 For use with above
Aquatrode Plus Metrohm 6.0253.100 For use with above
Centrifuge Sorvall ST16 Thermo Scientific 11814243 Code is for Fisher scientific
UV-Vis spectrophotometer Genesys 10A Thermo scientific 12104972 Code is for Fisher scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Swaisgood, H. E. The use of immobilized enzymes to improve functionality. Proteins Food Process. , 607-630 (2004).
  2. Hartmann, M., Kostrov, X. Immobilization of enzymes on porous silicas – benefits and challenges. Chem Soc Rev. 42 (15), 6277 (2013).
  3. Hudson, S., Cooney, J., Magner, E. Proteins in Mesoporous Silicates. Angew Chemie Int Ed. 47 (45), 8582-8594 (2008).
  4. Hanefeld, U., Gardossi, L., Magner, E. Understanding enzyme immobilisation. Chem Soc Rev. 38 (2), 453-468 (2009).
  5. Magner, E. Immobilisation of enzymes on mesoporous silicate materials. Chem Soc Rev. 42 (15), 6213-6222 (2013).
  6. Rodrigues, R. C., Ortiz, C., Berenguer-Murcia, &. #. 1. 9. 3. ;., Torres, R., Fernández-Lafuente, R. Modifying enzyme activity and selectivity by immobilization. Chem Soc Rev. 42 (15), 6290-6307 (2013).
  7. Forsyth, C., Patwardhan, S. V. . Bio-Inspired Silicon-Based Materials. 5, (2014).
  8. Luckarift, H. R., Spain, J. C., Naik, R. R., Stone, M. O. Enzyme immobilization in a biomimetic silica support. Nat Biotechnol. 22 (2), 211-213 (2004).
  9. Betancor, L., Luckarift, H. R. Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis. Trends Biotechnol. 26 (10), 566-572 (2008).
  10. Livage, J., Coradin, T., Roux, C. Encapsulation of biomolecules in silica gels. J Phys Condens Matter. 13 (33), R673-R691 (2001).
  11. Hartmann, M., Jung, D. Biocatalysis with enzymes immobilized on mesoporous hosts: the status quo and future trends. J Mater Chem. 20 (5), 844 (2010).
  12. Carlsson, N., Gustafsson, H., Thörn, C., Olsson, L., Holmberg, K., Åkerman, B. Enzymes immobilized in mesoporous silica: A physical-chemical perspective. Adv Colloid Interface Sci. 205, 339-360 (2014).
  13. Manning, J. R. H., Yip, T. W. S., Centi, A., Jorge, M., Patwardhan, S. V. An Eco-Friendly, Tunable and Scalable Method for Producing Porous Functional Nanomaterials Designed Using Molecular Interactions. ChemSusChem. 10 (8), 1683-1691 (2017).
  14. Drummond, C., McCann, R., Patwardhan, S. V. A feasibility study of the biologically inspired green manufacturing of precipitated silica. Chem Eng J. 244, 483-492 (2014).
  15. Patwardhan, S. V. Biomimetic and bioinspired silica: recent developments and applications. Chem Commun. 47 (27), 7567-7582 (2011).
  16. Iler, R. K. . The Chemistry of Silica: Solubility, Polymerization, Colloid and Surface Properties and Biochemistry of Silica. , (1979).
  17. Forsyth, C., Yip, T. W. S., Patwardhan, S. V. CO2 sequestration by enzyme immobilized onto bioinspired silica. Chem Commun (Camb). 49 (31), 3191-3193 (2013).
  18. Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Controlling performance of lipase immobilised on bioinspired silica. J Mater Chem B. 1 (8), 1164 (2013).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  20. Ewlad-Ahmed, A. M., Morris, M. A., Patwardhan, S. V., Gibson, L. T. Removal of formaldehyde from air using functionalized silica supports. Environ Sci Technol. 46, 13354-13360 (2012).
  21. Yang, S. H., Ko, E. H., Jung, Y. H., Choi, I. S. Bioinspired functionalization of silica-encapsulated yeast cells. Angew Chemie. 50 (27), 6239-6242 (2011).
  22. Alotaibi, K. M., et al. Iron supported on bioinspired green silica for water remediation. Chem Sci. 8 (1), 567-576 (2017).
  23. Davidson, S., Lamprou, D. A., Urquhart, A. J., Grant, M. H., Patwardhan, S. V. Bioinspired Silica Offers a Novel, Green, and Biocompatible Alternative to Traditional Drug Delivery Systems. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1493-1503 (2016).
  24. Patwardhan, S. V., Perry, C. C. Synthesis of enzyme and quantum dot in silica by combining continuous flow and bioinspired routes. Silicon. 2 (1), 33-39 (2010).
  25. Nozawa, K., et al. Smart control of monodisperse stöber silica particles: Effect of reactant addition rate on growth process. Langmuir. 21 (4), 1516-1523 (2005).
  26. Belton, D. J., Patwardhan, S. V., Annenkov, V. V., Danilovtseva, E. N., Perry, C. C. From biosilicification to tailored materials: optimizing hydrophobic domains and resistance to protonation of polyamines. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (16), 5963-5968 (2008).
  27. de Ávila, S. G., Silva, L. C. C., Matos, J. R. Optimisation of SBA-15 properties using Soxhlet solvent extraction for template removal. Microporous Mesoporous Mater. 234, 277-286 (2016).
  28. Cassiers, K., Van Der Voort, P., Vansant, E. F. Synthesis of stable and directly usable hexagonal mesoporous silica by efficient amine extraction in acidified water. Chem Commun. (24), 2489-2490 (2000).
  29. Tanev, P. T., Pinnavaia, T. J. Mesoporous Silica Molecular Sieves Prepared by Ionic and Neutral Surfactant Templating: A Comparison of Physical Properties. Chem Mater. 8 (8), 2068-2079 (1996).

タグ

Bioinspired SilicaFunctional SilicaRapid SynthesisEnzyme EncapsulationPH-dependent Silica FormationSodium SilicatePentaethylene HexamineHydrochloric Acid

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Manning, J. R., Routoula, E., Patwardhan, S. V. Preparation of Functional Silica Using a Bioinspired Method. J. Vis. Exp. (138), e57730, doi:10.3791/57730 (2018).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image