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医学

Isolement de cellules souches intestinales et de la Culture dans un modèle porcin de l’ischémie intestinale segmentaire petit

Published: May 18, 2018
doi:
10.3791/57647
, , ,
1Department of Clinical Sciences,North Carolina State University

概要

Ce protocole permettra aux lecteurs d’établir avec succès un modèle porcin de l’ischémie intestinale segmentaire et ensuite isoler et de la culture des cellules souches intestinales pour l’étude de réparation épithéliale après une blessure.

Abstract

Ischémie intestinale reste une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les patients humains et vétérinaires. De nombreux processus morbides se traduire par ischémie intestinale, l’approvisionnement en sang et donc l’oxygène est diminuée à l’intestin. Ce qui conduit à la perte de la barrière intestinale et endommager les tissus sous-jacents. Les cellules souches intestinales se trouvent à la base des cryptes de Lieberkühn et sont responsables du renouveau intestinal au cours de l’homéostasie et après une blessure. Ex vivo des techniques de culture cellulaire ont permis l’étude réussie des interactions entre cellules souches épithéliales en établissant les conditions de culture qui favorise la croissance des systèmes tridimensionnels à analogues aux organes épithéliales (appelé « enteroids » et » colonoids » de l’intestin de petite et grande, respectivement). Ces enteroids sont composées de cryptes et de villosités comme domaines et mature pour contenir tous les types de cellules dans l’épithélium. Historiquement, les modèles murins ont été utilisés pour étudier les lésions intestinales. Cependant, un modèle porcin offre plusieurs avantages, y compris la similitude de taille comme digestif anatomie et physiologie à celui des humains. En utilisant un modèle porcin, nous établissons un protocole dans lequel segmentaires boucles d’ischémie intestinale peuvent être créés au sein d’un seul animal, permettant l’étude des différents points d’une lésion ischémique du temps et réparer in vivo. En outre, les auteurs décrivent une méthode pour isoler et les cellules souches intestinales des boucles ischémiques de l’intestin, de la culture permettant l’étude continue de réparation épithéliale, modulée par les cellules souches, ex vivo.

Introduction

Une lésion ischémique intestinale, le résultat de la disponibilité de l’oxygène diminuée en raison d’une réduction ou une occlusion complète du débit sanguin dans l’intestin, reste une cause importante de morbidité et de mortalité chez les patients humains et animaux1,2. Dommages ischémiques, ainsi que l’inflammation subséquente et infiltration cellulaire, conduit au compromis de la barrière muqueuse. La barrière muqueuse est essentielle à la prévention de la translocation bactérienne et les toxines associées dans la circulation systémique3,4. La reperfusion subséquente des tissus ischémiques peut entraîner la formation d’endommager les espèces réactives de l’oxygène qui peuvent aggraver les blessures5. Ischémie intestinale étant rarement évitable, recherches plus récentes ont porté sur l’avancement des techniques de détection précoce d’ischémie et l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques qui réduisent la reperfusion blessures ou cible muqueuse réparation.

Des modèles animaux ont servi largement à élargir nos connaissances sur les sciences fondamentales d’ischémie-reperfusion et reste indispensable pour la recherche translationnelle. Les modèles de rongeurs ont été le plus largement utilisé en raison de leur capacité à être génétiquement manipulés6. Plus récemment cependant, l’utilisation de grands modèles animaux, plus particulièrement le porc, est préconisée pour les futures études translationnelles en raison d’un certain nombre d’avantages, y compris les similitudes anatomiques et physiologiques de porcs humains7,8. Une variété de modèles de lésion ont été développés pour l’étude d’ischémie-reperfusion et comprennent une occlusion vasculaire complete, faible débit ischémie et occlusion vasculaire mésentérique segmentaire. Un examen complet de ces modèles est en dehors du domaine de cet article, toutefois les auteurs directement lecteurs à une récente révision3.

En plus des modèles in vivo , l’utilisation des systèmes de culture cellulaire ex vivo propose un outil prometteur pour étudier l’homéostasie intestinale et la réparation après une blessure. Les cellules souches intestinales sont responsables de la prolifération cellulaire et le renouvellement de la muqueuse épithéliale intestinale. Lorsque isolées de l’intestin normal ou blessé, les cellules souches intestinales peuvent être maintenues en culture et servir de modèle pour l’étude des cellules souches et biologie des cellules épithéliales ou outil. Méthodes d’isoler et de mettre en place ces trois dimensions culture systèmes (appelés enteroids et colonoids lorsqu’il est dérivé de l’intestin de petite et grande, respectivement) ont été décrites pour une variété d’espèces et orgue systèmes9,10 ,11,12,13. Plus précisément, dans le tube digestif, ces systèmes de culture ont été utilisés pour les maladies gastro-intestinales modèle dont le cancer, infection par des pathogènes et de maladies inflammatoires de l’intestin14. Pour l’instant, il n’y a pas de rapports décrivant l’isolement et l’entretien des cellules souches intestinales de réponses blessé petit intestin chez toutes les espèces. Par conséquent, nous décrivons ici le processus d’ischémie intestinale dans un modèle porcin animal roman, large qui se traduit par des blessures reproductible et la capacité à isoler des cellules souches intestinales de l’intestin normal et ischémie blessé pour l’étude supplémentaire de récupération ex vivo.

Protocol

Pour ces expériences, toutes les études animales ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de North Carolina State University. 1. préparation de la Culture Remarque : Tous les réactifs sont répertoriés dans la Table des matières. Les concentrations de facteur de croissance spécifiques sont répertoriées dans le tableau 1. Préparer une solution d’acide (EDTA) éthylènediaminetétraacétique 0,5 M dans l’eau désionisée distillée (ddH2O). Mélanger convenablement et ajuster le pH à 7.4 à l’aide de solutions de NaOH ou HCl.NOTE : Composent solution d’EDTA frais avant chaque expérience. Préparer le réactif de dissociation #1 (DR #1) comme suit et le placer sur la glace : tamponnée au phosphate de combiner une solution saline sans Ca2 + et Mg2 + (PBS), 0,5 M EDTA, 1 M 1, 4-le dithiothréitol (DTT), 10 µM Y27632 et 1 X antibiotique-antimycosiques solution (anti-Anti) contenant de la pénicilline, la streptomycine et amphotéricine b.NOTE : Ajouter Y27632 immédiatement avant le prélèvement de tissu. Préparer le réactif de dissociation #2 (DR #2) comme suit et le placer dans un bain-marie à 37 ° C : PBS de combiner sans Ca2 + et Mg2 +, EDTA de 0,5 M, 10 µM Y27632 et 1 X anti-Anti. NOTE : Ajouter Y27632 immédiatement avant le prélèvement de tissu. Préparer les cellules souches épithéliales intestinales (IESC) médias comme suit : Mélanger 25 mL avancé le milieu DMEM/F12 avec 1 Supplément N2 X, 1 X B-27 supplément, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax et 1 X anti-Anti. Conserver à 4 ° C jusqu’à l’utilisation. Préparer un mélange maître de facteur de croissance réduite membrane basale matrix (matrice) et des facteurs de croissance supplémentaires comme suit : dégeler la matrice sur la glace. Dans un tube de microcentrifuge, ajoutez 100 ng/mL caboche humaine recombinante, 500 ng/mL 1 R-Spondin humaine recombinante, 50 ng/mL recombinant humain facteur de croissance épidermique (EGF), 100 ng/mL Wnt3a humaine recombinante, 10 mM, Nicotinamide, gastrine nM 10 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 et inhibiteur de kinase 3 2,5 µM glycogène synthase (GSK3i, CHIR99021). Lorsque la matrice est décongelée, compléter avec le mélange de facteur de croissance (fabrication de mélange principal) et stocker sur la glace.Remarque : Veillez à éviter l’introduction de bulles d’air car cela créera artefact dans la galette de la matrice au cours de l’électrodéposition. Préchauffer un plat de 24 puits tissue culture dans un incubateur à 37 ° C avant de commencer les procédures d’isolement cellulaire. 2. modèle chirurgical de l’ischémie et prélèvement tissulaire Utilisation de huit à dix semaines Yorkshire croisés porcs des deux sexes (recommandé). Supprimer tous les aliments pour animaux 16-18 h avant la chirurgie. Permettre aux porcs accès à l’eau en permanence. Planifier les porcs pour arriver au moins 48 h avant les expériences permettant l’acclimatation environnementale.Remarque : Des techniciens vétérinaires et/ou biologique, supervisés par un vétérinaire licencié fournissent des soins courants aux animaux et assistance aux procédures anesthésiques. Premedicate le cochon avec la xylazine (1,5 mg/kg par voie intramusculaire (IM)) et la kétamine (11-20 mg/kg (IM))15. Une fois calme, intuber l’orotracheally de porc. Maintenir les porcs sous anesthésie générale à l’isoflurane (2-5 %), vaporisé dans 100 % O2 jusqu’au moment de l’euthanasie. Placer le cathéter intraveineux (IV) (veine d’oreille recommandé) et administrer un fluide de remplacement comme solution de Ringer à un taux de maintenance de 15 mL/kg/h. Exécuter la routine anesthésique suivi y compris oxymétrie de pouls, électrocardiographie et de mesures indirectes artérielle15. Surveiller la fréquence respiratoire du porc et l’effort et ventiler manuellement ou mécaniquement au besoin si fin marée CO2 s’élève au-dessus de 55 à 60 mmHg.Remarque : Une anesthésie appropriée est confirmée par une surveillance continue des tendances de la fréquence cardiaque (plage 80-130 battements/min), la pression artérielle non invasive (moyenne pression artérielle 75-100 mmHg) et la fréquence respiratoire (10-25 respirations/min)16et vérification périodique absence de mâchoire et tonus anal. Profondeur de l’anesthésie peut également être jugée selon le degré de la relaxation musculaire et fasciculation musculaire après stimulation chirurgicale. Réflexes oculaires sont généralement d’aucune valeur16. L’analgésie peut être fournie selon les directives de la politique IACUC institutions. Dans ce cas, un opioïde, comme la buprénorphine, peut être administré pendant une intervention chirurgicale. Placez le cochon sur un coussin chauffant et restrain en décubitus dorsal pour l’intervention chirurgicale. Se raser l’abdomen ventral et de préparation à l’aide du chirurgien (solution de chlorhexidine) et l’alcool isopropylique. Faites une incision de la ligne médiane ventrale de 8-10 cm à l’aide d’une lame de bistouri Swann-Morton, centrée à l’ombilic à accéder à l’abdomen. Identifier l’intestin grêle (jéjunum) environ 40 cm par voie orale à la jonction iléo-caecale. Délimiter les boucles longues de 10 cm de jéjunum en circonférence ligaturant l’intestin deux fois, un cm entre chaque ligature, avant de créer les boucles 10 cm situé par voie orale (Figure 1). Créer deux boucles par point dans le temps d’ischémie adjacent à l’autre, l’un pour l’ischémie et l’autre pour ischémie avec 1h de reperfusion supplémentaires si vous le souhaitez. Pour créer une ischémie complète (pas de débit des artères ou des veines), pince ou ligaturer les vaisseaux mésentérique utilisant des clamps vasculaires bulldog, hémostatique de moustique Halstead courbe ou soie non résorbable 2-0 pour 1, 2, 3 et 4h et puis retirer les pinces pour 1h de reperfusion, si vous le souhaitez.Remarque : Les auteurs créé toutes les boucles de l’ischémie en ordre en commençant par la boucle ischémique de 4h et progressait de déplacement dans la partie proximale (minimiser le temps total de la chirurgie). Pour répondre à la possibilité que les voisins des segments intestinaux ischémiques peuvent endommager boucles adjacentes, l’ordre des boucles ischémiques peut varier. Cela peut modifier la durée chirurgicale totale.NOTE : Le délai de reperfusion peut varier selon la question de recherche d’intérêt ou si les thérapies souhaitent être contrôlées au cours de la période de reperfusion. Toutefois, comme des lésions tissulaires devient plus sévère de l’augmentation des durées d’ischémie seul, lésion de reperfusion probable ne contribue pas à une aggravation du préjudice épithélial. Reperfusion joue-t-il probablement un rôle après des périodes douces d’une lésion ischémique. Entre moments d’ischémie, garder l’abdomen couverte ou fermée à l’aide d’une serviette stérile et/ou une pince serviette.Remarque : Au sein d’un seul animal pour cette expérience, huit segments ischémiques peuvent être créés. Identifier un segment jéjunal supplémentaires, au moins 5-10 cm de proximal à la dernière boucle ischémique, qui servira de témoin interne normale. Obstruez environ trois vaisseaux mésentériques par pince vasculaire bulldog ou hémostatique de moustique Halstead courbe. Il faut lors de l’application de la pince hémostatique car les vaisseaux sont facilement traumatisés. Essayez d’empiler les vaisseaux dans les mâchoires de la pince. À la fin de l’expérience, suivant l’euthanasie avec pentobarbital 85-100 mg/kg IV, recueillir toutes les boucles du tissu à l’aide de ciseaux de metzenbaum, après que la mort a été confirmée sans auscultated du rythme cardiaque et de la perte du réflexe cornéen. Commencez par recueillir un morceau de contrôle de jéjunum normal au moins 5 – 10 cm proximaux à la dernière boucle ischémique. Trient et stockent les boucles de chaque instant de blessure dans de petits contenants de PBS de glace froide jusqu’au moment de l’isolement de la crypte.Remarque : Si vous le souhaitez, faire ischémique boucles assez longtemps pour diviser en échantillons distincts pour l’histologie et de la culture de cellules souches intestinales ; Cependant, les auteurs ont trouvé que les boucles supérieures à environ 10 cm de long sont plus susceptibles de devenir hémorragiques. 3. crypte (cellules souches) Isolation d’ischémique et le contrôle des boucles Il faut inverser chaque boucle de l’intestin grêle à l’aide d’un fil de calibre 20 et forceps tissue d’exposer la surface de la muqueuse. Attachez le haut et le bas de la boucle solidement au fil à l’aide de la suture (2-0 soie non résorbables ou équivalent). Après inversion, rincer chaque boucle dans du PBS froid glace pour enlever les débris luminale. Placer les échantillons immédiatement sur les tubes coniques de 50 mL contenant DR #1 sur la glace pendant 30 min. Collecter les lignes commençant par contrôle et suivez avec boucles d’accroître progressivement la durée d’ischémie. Boucles de moins (c.-à-d. contrôle et 1 h tissu ischémique) les tissus endommagés peuvent être secoués vigoureusement, enclenchant le poignet pour de meilleurs résultats. Tissus de tissus gravement endommagés (3 et 4 h d’ischémie) devraient être doucement bercés ou inversés seulement car trop d’agitation provoquerait une perturbation de la crypte et la destruction des tissus supplémentaires. Tubes doivent être secoués ou inversés toutes les 5 min alors que sur la glace. Transférer les échantillons dans DR #2 pendant 10 min dans un bain-marie à 37° C. Agiter ou inverser les tubes toutes les 5 min. Après avoir transféré les tissus, centrifuger les tubes coniques contenant DR #1 des boucles de 2 à 4 h endommagé pour éliminer le surnageant EDTA (200 x g pendant 5 min). Comme ces tissus sont très endommagés, il est possible des que cryptes ont déjà devenir dissociées. Éliminer le surnageant et Resuspendre le culot avec un petit volume de PBS (5 mL) et passez à l’étape 3.9. Prélèvement d’échantillons de DR #2 et placer les échantillons de tissu directement dans 25 mL de PBS froid sur la glace (étiquette que lavage #1). Placer les échantillons dans un agitateur orbital sur glace à 60 tr/min. Continuer à secouer ou inverser chaque tube pendant 30 s toutes les 2 à 5 min. Après avoir transféré les tissus, spin les tubes coniques contenant DR #2 de la 2-4 h endommagé boucles pour éliminer le surnageant d’EDTA (200 x g pendant 5 min). Comme ces tissus sont fortement endommagés, il est possible que les cryptes ont devenu dissociées. Éliminer le surnageant et Resuspendre le culot avec un petit volume de PBS (5 mL) et passez à l’étape 3.9. Enlever une quantité de 50 µL de lavage #1 (ou de la République dominicaine) pour vérifier le degré de dissociation de la crypte et la quantité de débris. Placer le tissu dans un nouveau tube conique de 50 mL (lavage #2, #3, etc.) rempli de 25 mL de froid PBS et agiter jusqu’à ce qu’intactes cryptes sont isolés avec des débris minime et villosités.NOTE : L’objectif est de pouvoir isoler une fraction propre avec intactes cryptes et débris minime. Chaque lavage supplémentaire va nettoyer les cellules cependant trop d’agitation commence à causer des dommages secondaires de tissus/cellules. En outre, les meilleurs résultats avec moins de contamination seront fera si les cryptes sont plaqués d’une étape de lavage et non d’une étape de réactif de dissociation. Enlever le tissu restant puis centrifuger les tubes coniques de 50 mL à 200 x g pendant 5 minutes pour éliminer le liquide surnageant resuspendre restant le culot de la crypte en plus petit volume de PBS (5 mL). À l’aide d’un microscope inversé, examiner 50 µL d’extraits de chaque échantillon afin de déterminer le nombre de cryptes/fraction. L’objectif est de 50-100 µL de cryptes/50, car ce sera la taille de la galette de la matrice finale.Remarque : Si l’échantillon est trop concentrée, continuer à ajouter des PBS froide jusqu’à obtenir la concentration désirée. Si l’échantillon est trop dilué, déterminer le nombre de parties aliquotes nécessaires pour atteindre le rendement désiré crypte et ajuster. Aliquotes ou les volumes appropriés des cryptes (déterminées par des observations aliquotes) dans un tube de microcentrifuge. Par exemple, si l’échantillon contient 50 µL de cryptes/50 puis aliquote 50 µL par patty réplique X 3 = 150 µL / tubes de microcentrifuge. Si l’échantillon ne contient que 25 µL de cryptes/50 puis 2 aliquotes nécessaires / patty X 3 réplique = 300 µL/tube. Cryptes de pellet à 200 x g pendant 5 min à 4° C. Doucement remettre en suspension les cryptes granulés avec un volume approprié de mélange principal (50 µL / puits). Bien mélanger par pipetage rapidement 15 fois sans créer de bulles d’air.NOTE : Refroidir préalablement l’embout de la pipette avec froide PBS stérile avant d’aspirer le mélange principal. Cela aidera à garder les master mix d’étendage. Conseils aussi peuvent être conservés au réfrigérateur et placés dans la hotte immédiatement avant leur utilisation. Distribuer un mélange maître µL, 50 plus goutte crypte au centre de chaque puits d’une plaque bien 24 préchauffé. Incuber la plaque de culture pendant 30 min à 37 ° C. Superposer chaque galette de matrice avec 500 µL / puits de médias IESC (aucun facteur de croissance supplémentaire nécessaire au jour 0, car elles sont contenues dans le mélange maître). Ajouter 500 µL PBS stérile à n’importe quel puits inutilisés à gauche sur la plaque à maintenir l’humidité. Compter nombre de cryptes plaqués le jour 0.Remarque : Il est utile de la pré-grille, chaque cellule culture plaque en quadrants pour aider à assurer un comptage plus précis. Compter le nombre d’enterospheres toutes les 24 h et surveiller pour le développement d’enteroid tous les jours. Ajouter des facteurs de croissance pour chaque bien chaque 48 h. Retirez les médias IESC toutes les 96 h et remplacez-le par supports neufs de 500 µL (facteurs de croissance doivent ensuite être ajoutés aux médias).

Representative Results

L’ischémie intestinale complète a été créé en petites anses intestinales en utilisant une occlusion vasculaire avec suture ou pinces tel qu’illustré à la Figure 1. En libérant les pinces, une période contrôlée de reperfusion peut être effectuée, permettant une étude supplémentaire de lésion de reperfusion ultérieures si vous le souhaitez. Tous les animaux ont survécu au cours de la procédure avec complication minime jusqu’à l’euthanasie. Complication chirurgicale la plus fréquente était une hypotension, qui a résolu avec la supplémentation d’un inotrope positive comme la dobutamine. Si fait correctement, une lésion ischémique commencera à la pointe de la villosité intestinale et migrent vers le bas, dans la crypte, comme la durée des augmentations de l’ischémie (Figure 2). Une erreur commune avec la technique chirurgicale peut se produire lorsque les vaisseaux sanguins ne sont pas ligaturées ou serrés uniformément. Il en résulte une ischémie hémorragique (Figure 3), dans lequel la veine à paroi mince s’effondre avant de l’artère, permettant de sang supplémentaire de s’infiltrer dans les tissus. Grossièrement, cela se voit comme une sombre pourpre séreuse surface (Figure 3, à gauche) par rapport à une surface plus pâle pendant l’ischémie complète (Figure 3, droite). Après le retrait de l’anses intestinales ischémiques, des cryptes intestinales ont été avec succès isolés suivant le protocole de dissociation (Figure 4). Comme prévu, les cryptes de points plus sévèrement endommagés étaient souvent cassés (f ; fragment) et crypte fractions contiennent plus de débris cellulaires fond comparativement à ceux qui ont subi no ou dommages doux. Pendant le protocole, l’intestin grièvement blessé doit être agité doucement pour éviter d’autres dommages au tissu sous-jacent. Secouant trop gros peut entraîner dégâts supplémentaires crypte et la majorité des cryptes se retrouvent dans les solutions de DR contenant de l’EDTA, ce qui entraîne des perturbations supplémentaires. Une fois plaqué, cryptes de tous les points dans le temps d’ischémie survivent et sont en mesure de s’établir dans la culture (Figure 5). Quand des cryptes intestinales normales et légèrement endommagés sont plaqués dans la culture, enterospheres forme sous 24-48 h. Avec les graves dommages ischémiques (3 et 4 h), les cryptes intestinales survivent mais sont endommagés, entraînant la formation de plus petites sphères au départ. Par 72-120 h, enteroids deviennent plus complexes avec des lumens centrales évidents et structures en herbe. Dans l’ensemble, il y a une efficacité de diminution de la croissance de cryptes, ainsi qu’une taille réduite d’enteroids dérivé de tissu intestinal gravement endommagé (Gonzalez, L.M., données non publiées, 2017). Figure 1 : Modèle chirurgical de l’ischémie intestinale complète dans un modèle porcin. A) normal jéjunum de porc extériorisée. B) mésentériques navires ont été ligaturés avec suture création d’ischémie intestinale. C) ischémie créée à l’aide de clamps vasculaires bulldog afin de permettre une reperfusion tissulaire si vous le souhaitez. D) intestinale vascularisation immédiatement après le retrait des clamps vasculaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Preuve histologique (hématoxyline et éosine (H & E) tache) de plus en plus des lésions épithéliales suite à des durées plus longues de l’ischémie intestinale complète. Dommages commence à l’extrémité de la villosité avec perte progressive de la couche épithéliale monocellulaires, émoussant de villosités et des dommages cellulaires qui s’étend jusqu’à la crypte de base avec des blessures graves (jusqu’à 4 h durée). barre d’échelle 100 µm. J’ai = ischémie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Des preuves flagrantes et histologique d’ischémie hémorragique. A) brut photo comparant l’ischémie hémorragique (boucle de gauche) et l’ischémie complète (boucle de droite). Lorsque le système vasculaire n’est pas ligaturé ou serré uniformément, sang peut continuer à s’infiltrer dans les tissus, entraînant des dommages et d’inflammation supplémentaire. B) les images H & E d’ischémie hémorragique de l’augmentation de la durée de 1 à 4 h. En plus des dommages cellulaires observés avec ischémie complète, il y a preuve d’infiltration de globules rouges dans la lamina propria environnante. barre d’échelle 100 µm. J’ai = ischémie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Parties aliquotes de cryptes intestinales isolées de boucles d’intestin ischémique et normale. Complets, intactes cryptes intestinales (astérisques) ont été avec succès isolés de chaque boucle de l’intestin. Comme prévu, les cryptes de plusieurs points dans le temps gravement endommagés étaient souvent brisés (f ; fragment) et crypte fractions contiennent plus de débris cellulaires fond comparativement à ceux qui ont subi no ou dommages doux. barre d’échelle 100 µm. J’ai = ischémie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Évolution temporelle de la croissance de cellules souches intestinales après isolement de boucles ischémiques de l’intestin grêle. Lorsque des cryptes intestinales normales ont été cultivées dans la culture, enterospheres formé sous 24-48 h. Avec les graves dommages ischémiques (3 et 4 h), cryptes survivent mais forment des sphères beaucoup plus petites au départ. Par 72-120 h, enteroids deviennent plus complexes avec des lumens centrales évidents et structures en herbe. 20 µm échelle bar sauf indication contraire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Facteur de croissance Diluant Concentration de stock Dilution de stock Dilution de travail R-Spondin PBS 100 X 100 µg/ml 1 µg/ml Caboche SW/0.1%BSA 1000 X 100 µg/ml 100 ng/ml EGF 10mM d’acide acétique 10 000 X 500 µg/ml 50 ng/ml A-83-01 DMSO 1000 X 500 ΜM 500 nM SB202190 DMSO 3000 X 30 mM 10 ΜM Nicotinamide SW 1000 X 1 M 1 mM Gastrine PBS 10 000 X 100 ΜM 10 nM Y-27632 PBS 1000 X 10 mM 10 ΜM LY2157299 DMSO 10 000 X 5 mM 0,5 ΜM CHIR99021 PBS 1000 X 2,5 mM 2,5 ΜM Wnt3a PBS 2000 X 200 µg/ml 100 ng/ml Tableau 1 : tableau de facteur de croissance réactif. Résumé des solutions mères de facteur de croissance et des solutions de travail utilisées dans le présent protocole.

Discussion

L’élaboration d’un modèle porcin de l’ischémie intestinale segmentaire élargit les précédents modèles murins en tenant compte de l’étude de plusieurs points dans le temps d’une lésion tissulaire dans le même animal. Il y a plusieurs points de la discussion critique du présent protocole, y compris la ligature bon navire, reperfusion tissulaire et culture cellulaire crypte réussie.

La ligature de navire adéquat est essentielle à la création d’un modèle d’ischémie complète. Si la suture est liée de façon inégale ou la pince pas vissé complètement, sang de l’artère à parois épaisses peut-être continuer à entrer dans le tissu et ne peut pas sortir en raison de l’effondrement de la veine à paroi mince. Cela se traduit par l’extravasation du sang dans la lamina propria, causant des dommages de tissu supplémentaire. Toutefois, selon le type de lésion ischémique étudiée, ischémie complète ou hémorragique peut être souhaitable. Par exemple, dans le processus de transplantation intestinale, l’intestin est complètement séparé de l’apport vasculaire (artère et veine) pendant la phase de résection de la procédure, qui se traduit par une ischémie intestinale complète. Subsidiairement, toutefois, lorsque le mésentère est tordu lors d’un événement comme un volvulus intestinal, le retour veineux est souvent obstrué tout d’abord, menant à sang supplémentaire dans les tissus avant l’apport artériel étant obstrué, créant ainsi ischémie hémorragique.

Une lésion ischémique entraîne des lésions tissulaires à la pointe de villosités et de son prolongement jusqu’à la base de la crypte3. Au cours de l’ischémie, énergie sous la forme d’adénosine triphosphate continuent d’être utilisé et génère l’hypoxanthine métabolite. Lorsque le tissu est reperfusé avec l’oxygène, l’hypoxanthine est métabolisé par la xanthine oxydase et produit des radicaux libres de superoxyde conduisant à des lésions muqueuses et attraction de tissu endommageant neutrophiles17,18. Différences entre les espèces dans la muqueuse architecture vasculaire ainsi que l’expression variable de la xanthine oxydase, aboutir à des degrés divers de reperfusion injury3. Félines et rongeurs modèles d’ischémie-reperfusion sont plus sensibles aux lésions de reperfusion du oxygénées métabolites19,20. En revanche, porcs se sont révélés pour avoir moins xanthine oxydase et par conséquent moins lésion de reperfusion, rendant ce modèle plus comparable à celle de l’ischémie intestinale humaine21. A cette époque, l’utilisation de masquage ou modèles porcins transgéniques pour étudier les lésions intestinales n’a pas été décrites, ce qui en fait une limitation majeure de ce modèle. Le choix du modèle animal approprié dépend le processus de la maladie ou condition particulière le chercheur souhaite étudier. Par exemple, les modèles porcines de lésion ischémique jusqu’à 6 h ont été décrit22, tandis que des procédures plus ischémiques dans les modèles murins sont 45-60 min23.

Réussite de l’isolement des cryptes intestinales d’intestin normal et ischémie endommagé permet l’étude de récupération épithéliale en culture. Ce système permet au chercheur de se concentrer uniquement sur l’épithélium seul, comme il y a apport non vasculaire ou composante de cellules immunitaires à envisager. Cela offre la possibilité d’étudier les interactions entre les cellules épithéliales et récupération après une blessure en plus de la réponse à différents facteurs de croissance, ou des traitements administrés au cours de la chirurgie ou l’isolement de crypte suivants en complétant les milieux de culture. Cette étape reste le plus difficile, comme l’isolement des boucles gravement endommagés nécessite agitant doucement et une suppression rapide des solutions contenant de l’EDTA dans le cas où les cryptes ont devient prématurément dissocié. Si ces boucles d’intestin ne sont pas lavés, les cryptes ont le potentiel d’être contaminée dans la culture. Ainsi, la solution antibiotique-antimycosiques a été ajoutée à ces deux solutions DR en plus des médias IESC. Un autre point de discussion se concentre sur l’intestin recueillie dans un contrôle normal. Que les animaux subissent une anesthésie avec des altérations possibles dans la perfusion tissulaire systémique, ainsi que la possibilité de circuler des médiateurs inflammatoires secondaires à l’ischémie, tissu témoin même « normal » ne représente pas un véritable contrôle. Dans ces expériences, on remarque que le tissu témoin apparu grossièrement et histologiquement comparable aux tissus d’animaux qui n’ont pas subi d’ischémie dans d’autres expériences (Gonzalez, L.M., données non publiées, 2017).

En résumé, cette méthode décrit un modèle reproductible de l’ischémie intestinale porcin, qui modélise étroitement ce qui se passe dans une lésion ischémique humaine. En outre, l’isolement des cellules souches intestinales Loops ischémique est décrite, qui sert à étudier la réparation épithéliale et réponse possible au traitement dans la culture.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce projet a été soutenu par les NIH K01OD0199 NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 et Département des Sciences cliniques, diffusion fonds

Materials

Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free Fisher Scientific  BP-399 Dilute 1:10
Distilled, deionized water (ddH2O) Used to prepare EDTA and PBS
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Thermo Scientific 20688
Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED45 Make fresh before each experiment; pH 7.4
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 646563
Y-27632 Sigma Aldrich Y0503
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010
N2 Supplement Life Technologies 17502-048
B-27 Supplement Life Technologies 12587-010
HEPES Life Technologies 15630-106
Glutamax Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Gibco 15240-096 Anti-Anti solution
Recombinant human Wnt-3a R & D Systems 5036 WN/CF
Recombinant human Rspondin1 R & D Systems 4645- RS
Recombinant human Noggin R & D Systems 6057-NG
Recombinant human EGF R & D Systems 236-EG
LY2157299 SelleckChem 52230
CHIR99021 Cayman Chemical 13122
Human [leu]15-Gastrin 1 Sigma Aldrich G9145
SB202190 Sigma Aldrich 57067
A83-01 Tocris 2939
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092
Water, WFI Quality Corning, Inc. 25-055-CM Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
Matrigel Matrix, GFR Corning, Inc. 356231 Phenol red free
24 Well Culture Dish Corning, Inc. 3524
Conical Tube, 50 ml  Corning, Inc. 430828
Scalpel Handle World Precision Instruments 500236
Carbon Steel Surgical Blade, No. 10 World Precision Instruments 504169
Tissue Forceps World Precision Instruments 15918
Debakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501239
Mayo Scissors World Precision Instruments 501752 Curved or straight
Metzenbaum Scissors World Precision Instruments 501739
Mosquito Forceps, Curved World Precision Instruments 503724-12 Curved or straight (503728-12)
Hopkins Bulldog Clamp Stoelting Co. 52120-40P Straight
Silk, 2-0  Henry Schein 685S-BUT Any similar brand is acceptable
Towel Clamps World Precision Instruments 501700
Needle Holder World Precision Instruments V503382
Wire suture, 20 gauge Henry Schein 19075 Cut and straighten before use.
Surgical Towels Henry Schein ST1833 Any similar product is acceptable.
Lactated Ringers Solution Henry Schein 9851
Chlorhex antiseptic scrub (4%) Henry Schein VINV-CHMX-SCRB Any similar brand is acceptable
Isopropyl Alcohol 70% Henry Schein MS071HS Any similar brand is acceptable
IV catheter, 22 gauge Henry Schein 2225PUR May need 20g or 24 g depending on size of the vein
Xylazine (100 mg/ml) Henry Schein 33198
Ketamine (100 mg/ml) Henry Schein 11695-6835-1 Controlled medication
Isoflurane solution Henry Schein 10015516
Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml)) Vortech Pharm. Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.
Heating pad  Gaymar Tpump Core Warming System; others are available.
Mindray Datascope Monitor Mindray North America Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable
Vaporizer  Vetland Medical Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.
Fluid Pump Abbott Hospira Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.
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参考文献

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Stieler Stewart, A., Freund, J. M., Blikslager, A. T., Gonzalez, L. M. Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia. J. Vis. Exp. (135), e57647, doi:10.3791/57647 (2018).
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