概要

Verimli üretimi, pankreas/oniki parmak bağırsağı Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/pankreas ataları hPSCs yapışma kültürlerde üzerinden

Published: March 27, 2019
doi:

概要

Burada, pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut (PDX1+) hücreleri pankreas soy nesil için alan koloni sigara türü monolayer büyüme üzerinde tek hücre ayrışmış. Bu yöntem homojen hPSC elde edilen hücreleri, genetik manipülasyon üreten ve eleme için uygundur.

Abstract

İnsan pluripotent kök hücre (hPSC)-türetilmiş pankreas hücreleri rejeneratif tıp ve insan gelişim süreçlerini incelemek için bir platform için umut verici bir hücre kaynağı vardır. Stepwise gelişimsel süreçleri beyannamedir farklılaşma pankreas hücreleri pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ de dahil olmak üzere oluşturmak için en önemli yollarından biri yönlendirilir (PDX1+) pankreas progenitör hücre. Geleneksel iletişim kuralları ile küçük koloniler farklılaşma geçişini kısa bir süre sonra Başlat. Ancak, koloniler veya toplamları, hücre farklılaşması için PDX1 engel heterogeneities eğilimli durumdadır+ hücreleri. Burada, hPSCs PDX1 ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut+ hücreleri. Protokol dört adımlardan oluşur ve farklılaşma tohumlama Disosiye tek hücreleri tarafından başlatır. SOX17 indüksiyon+ kesin endoderm hücreleri PDX1 iki ilkel gut tüp işaretleri, HNF1β ve HNF4α ve nihai farklılaşma ifade tarafından takip edildi+ hücreleri. Mevcut Protokolü kolay kullanım sağlar ve geliştirmek ve verimsiz endodermal soy veya PDX1 ayırt etmek için daha önce bulunan bazı hPSC satırları farklılaşma verimliliğini stabilize+ hücreleri.

Introduction

Pankreas esas ekzokrin ve endokrin hücreleri oluşur ve onun disfonksiyon ya da aşırı pankreatit, diyabet ve pankreas kanseri gibi birçok hastalıklara neden olur. Pancreatopathy pathogeny aydınlatmak için pankreas hücrelerinin işlevini ve gelişim sürecinin analiz etmek gereklidir. Buna ek olarak, istikrarlı hücre kaynağı sağlam kalite ile hücre/doku takviyesi terapi kurmak için gereklidir. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC)-türetilmiş pankreas hücreleri bu amaçlar için umut verici bir hücre kaynak vardır ve farklılaşma Protokolü pankreas hücreleri doğru çalışılmış1,2,3, oldu 4. Pankreas β hücrelerinin tüp üretimi son gelişmeler yetişkin insan ve bu hücreleri Haritayı terapötik etkinlik implantasyon diyabetik modeli fareler2,3içine üzerine β hücrelerinin üretimi taklit. Buna ek olarak, çözümleme İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) sağlıklı ve tip 1 diyabet hasta bağış üretilen β hücrelerinin stres5ne zaman altında dahil olmak üzere hiçbir işlevsel farklılıklar ortaya. Ayrıca, hastalık fenotipleri kısmen hasta elde iPSCs veya hasta6,7aynı sitedeki Genetik mutasyonlar yataklık hPSCs ile indüklenen pankreas hücrelerinde yeniden.

HPSCs pankreas hücreleri üretmek için gelişimsel süreçleri beyannamedir kademeli yönlendirilmiş farklılaşma kullanılır. Pankreas bölgesi Y-box 17 (SOX17) belirleme seks ifade erken embriyonun endoderm katmandan türetilir ve forkhead kutusu A2 (FOXA2)8. Tabanlı üzerinde fare çalışmaları, Hepatosit nükleer faktör 1-beta (Hnf1β) ve Hepatosit nükleer faktör 4-alfa (Hnf4α) ifade tarafından işaretlenir ilkel gut tüp endodermal katman oluşturur. İlkel gut tüp hisli ve solunum aygıtı, sindirim sistemi ve organları gelişir. Uzama sonra meşru pankreas bölge posterior foregut bölge oluyor 1 (PDX1)8,9,10transkripsiyon faktörü pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein ifade tarafından işaretlenmiş gibi. PDX1 dorsal ve ventral bölümlerini+ gut tüp kalınlaşmasına 1 (NKX6.1)8,11pankreas transkripsiyon faktörü 1 alt birim alfa (PTF1A) ve NK6 homeobox ortak ifade tarafından işaretlenen formu pankreas tomurcukları için. Bu ifade pankreas organogenesis morfolojik başlangıcı işaretler. Bileşenleri pankreas tomurcukları olan pankreas endoderm hücreleri epitelyal yapıları12 dallı bir borulu ağı ve sonunda insülin salgılayan β-hücreleri de dahil olmak üzere ekzokrin ve endokrin hücrelere ayırt etmek ve glukagon salgılayan α-hücreleri. PDX1 ifade ilk, o zaman tüm pankreas geliştirme görülmektedir ve yerelleştirme β ve δ hücreleri9,13,14gösterir meşru pankreas bölge tespit edilmiştir. Her ne kadar Pdx1+ Ptf1a veya Nkx6.1 ifade değil hücre alan ayırır Gastrik test, oniki parmak bağırsağı, extrahepatic safra kanalını ve bazı bağırsak hücreleri geç aşamada fareler9, PDX1 geliştirme ortasında içine+ hücrelerin CSF’den pankreas insanlarda erken gelişimsel aşamada kabul edilir.

Burada, hPSCs PDX1 ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut+ hücreleri pankreas soy nesil için. Tohum tarafından Protokolü başlatır farklılaşma tek hücreler15,16,17ayrışmış. Genel olarak, farklılaşmamış hPSCs koloniler veya hücre toplamları süspansiyon veya yapışma olarak korunur. Sonuç olarak, kısa bir süre sonra passaging farklılaşma çoğu protokolleri başlatın. Koloniler veya toplamları durumda, hücre hangi engel kayma ve transkripsiyon heterogeneities18,19,20,21,22‘ ye, ancak, yatkındır kesin endoderm doğru ilk farklılaşma adım takip verimsiz farklılaşma tarafından PDX1 için+ hücreleri. Mevcut Protokolü geliştirmek ve farklılaşma verimlilik için kolay kullanım sunabilir verimsiz endodermal soy ve PDX1 ayırt etmek için daha önce bulunan bazı hPSC satırları23, + hücreleri 24 , 25.

Protocol

HPSCs kullanarak deneyler tıp bölümü ve lisansüstü tıp Fak., Kyoto Üniversitesi Etik Komitesi tarafından kabul edildi. 1. malzeme hazırlanması Not: Tüm medya ve reaktifler hücre kültüründe steril bir ortam hazırlamak. Temel kültür ortamına oda sıcaklığında (RT) kullanmadan önce ısınmak. Orta farklılaşma reaktifleri ayrıntılarını RT. 6 h içinde kullanılan Malzemeler tabloiçinde liste…

Representative Results

Yayılıyor hiPSCs (585A129,30) farklılaşma için uygun olan bir homojen monolayer (şekil 1B) form ve konsantre. Farklılaşmamış hiPSCs (sahne 0) ayrışmış ve düşük hücre yoğunluğu (105 hücreleri/cm2x 1-1.5) adlı tek hücreler olarak yeniden seçilir. 1 h içinde hücreleri plakasına eklenir ve çıkıntı göstermeye başlar. 1 günde hücreleri hızla ve de yüzey alanı yüzde 80-90’ını ka…

Discussion

PDX1 üretimi+ hücreleri oluşur birden çok adımı; Bu nedenle, uygun bir zamanda hücreleri tedavi için önemlidir. Adımları arasında kesin endoderm indüksiyon verimliliğini büyük ölçüde son indüksiyon verimliliği etkiler, muhtemelen çoğalırlar salgılar ve/veya diğer bulaşıcı lineage (yani, mesoderm ve hücrelerindeki ektoderm), girişim tarafından faktörler belirli farklılaşma bozabilir. Eğer SOX17 oranı+ hücreleri %80 düşük günde 4 (sahne 1B), PDX1 için verimli…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser kısmen Japonya toplumdan için promosyon, bilim (JSP’ler) Scientific Research (C) (JSP’ler KAKENHI Grant Number15K09385 ve 18 K 08510) aracılığıyla T.T. ve Grant-in-Aid JSP’ler araştırma Fellows (JSP’ler KAKENHI Grant numarası için finansman tarafından desteklenen 17J07622) A.K. ve tıbbi araştırma ve geliştirme (AMED) kendi araştırma yoluyla Japonya ajansı “IP’leri hücre araştırma, Araştırma Merkezi ağ rejeneratif tıp gerçekleşmesi için çekirdek Merkezi” K.O. için vermek Yazarlar Dr Peter Karagiannis yazı okumak için teşekkür ederiz.

Materials

3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine Toronto Research Chemicals K171000 CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid Santa Cruz Biotechnology SC-203303 TTNPB
50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 339652
Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] Abcam Ab76541 Anti-CDX2, × 1/1000 dilution
B-27 Supplement (50 ×) Thermo Fisher Scientific 17504-044 Serum-free supplement
BD FACSAria II Cell Sorter BD Biosciences For flow cytometry
Biomedical freezer SANYO MDF-U538 For -30 °C storing
Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber BIO-RAD 1450011 Counting slide glass
CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR Greiner bio-one 657165 For differentiation culture/6-well plate
Centrifuge TOMY AX-310 For cell culturing
Centrifuge TOMY MX-305 For RT-qPCR
CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386
CLEAN BENCH SHOWA KAGAKU  S-1601PRV Clean bench
Corning CellBIND 6-well plate Corning 3335 For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced Corning 354230 Basement membrane matrix
Corning Synthemax II-SC Substrate Corning 3535 For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs
Cryostat Leica Leica CM1510 S For immunostaining of aggregates.
Cytofix/Cytoperm Kit Becton Dickinson 554714 Perm/Wash buffer is  Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.
Dako pen Dako S2002 For immunostaining of aggregates
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher Scientific 18427-088 For RT-qPCR
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11055 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10036 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10040 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey Serum Merck Millipore S30 Donkey serum
D-PBS(-) without Ca or Mg Nacalai tesque 14249-95 DPBS
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer
Filter Tip, 1000 µL Watoson 124-1000S Use together with pipettes
Filter Tip, 20 µL Watoson 124-P20S Use together with pipettes
Filter Tip, 200 µL Watoson 124-P200S Use together with pipettes
Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700 For immunostaining
Forma Steri-Cycle CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 370A Incubator
HNF-1β Antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-7411 Anti-HNF1β, × 1/200 dilution
HNF-4α Antibody (H-171) Santa Cruz Biotechnology sc-8987 Anti-HNF4α, × 1/200 dilution
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 For nucleus staining, × 1/200 dilution
Human Pancreas Total RNA Ambion AM7954 For RT-qPCR
Human PDX-1/IPF1 Antibody R&D Systems AF2419 Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution
Human SOX17 Antibody R&D Systems AF1924 Anti-SOX17, × 1/200 dilution
Improved MEM Zinc Option medium Thermo Fisher Scientific 10373-017 iMEM
Incubation chamber Cosmo Bio 10DO For immunostaining of aggregates
Latex Examination Gloves Adachi
MAS coated slide glass Matsunami Glass 83-1881 For immunostaining of aggregates
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific 4346907 For RT-qPCR
Microscope Olympus CKX41N-31PHP For cell culturing
Microtube Watoson 131-515CS
Monoclonal Anti-α-Fetoprotein SIGMA A8452 Anti-AFP, × 1/200 dilution
Nanodeop 8000 Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Oligo dT FASMAC Custom made Oligo  For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldehyde, powder Nacalai tesque 26126-54 PFA, fixative, diluted in DPBS
Pharmaceutical refrigerator SANYO MPR-514 For 4 °C storing
PIPETMAN P  GILSON Pipette
Recombinant Human KGF/FGF-7 R&D Systems 251-KG KGF
Recombinant Human Noggin PeproTech 120-10C NOGGIN
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A R&D Systems 338-AC Activin A
ReverTra Ace (100 U/μL) TOYOBO TRT-101 For RT-qPCR
Rnase-Free Dnase Set (50) QIAGEN 79254 For RT-qPCR
Rneasy Mini Kit QIAGEN 74104 For RT-qPCR
RPMI 1640 with L-Gln Nacalai tesque 30264-85 RPMI 1640
Sealing Film for Real Time Takara NJ500 For RT-qPCR
Serological pipettes 10 mL Costar/Corning 4488 For cell culturing
Serological pipettes 25 mL Costar/Corning 4489 For cell culturing
Serological pipettes 5 mL Costar/Corning 4487 For cell culturing
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb Cell signaling 3579S Anti-SOX2, × 1/200 dilution
StepOnePlus Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Sucrose Nacalai tesque 30406-25 For immunostaining of aggregates
TB Green
Premix Ex Taq II 
Takara RR820B For RT-qPCR
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450101J1 Automatic cell counter
Tissue-Tek OCT compound 4583  Sakura Finetechnical 4583 For immunostaining of aggregates
Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters Sakura Finetechnical 4566 For immunostaining of aggregates
Triton X-100 Nacalai tesque 35501-15
Trypan Blue BIO-RAD 1450021
Ultracold freezer SANYO MDF-U33V For -80 °C storing
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-038 Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Y-27632 Wako 251-00514

参考文献

  1. D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from ‘induced pluripotent stem cells’ of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).

Play Video

記事を引用
Toyoda, T., Kimura, A., Tanaka, H., Osafune, K. Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures. J. Vis. Exp. (145), e57641, doi:10.3791/57641 (2019).

View Video