Efficiënte generatie van alvleesklier/twaalfvingerige darm Homeobox eiwit 1⁺ Posterior voordarm/Pancreatic voorlopercellen van hPSCs in hechting culturen

De alvleesklier bestaat voornamelijk uit exocrine en endocriene cellen, en zijn dysfunctie of overbelasting veroorzaakt verschillende ziekten, zoals diabetes, pancreatitis en alvleesklierkanker. Om het verhelderen van de pathogeny van pancreatopathy, is het noodzakelijk om te analyseren de ontwikkelingstoxiciteit proces en functie van cellen van de alvleesklier. Daarnaast is de levering van een stabiele cel met robuuste kwaliteit vereist om de cellen/weefsels suppletie therapie. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide pancreatic cellen zijn een veelbelovende cel bron voor deze doeleinden, en het protocol van de differentiatie naar pancreatic cellen is intensief bestudeerde^{1,2,3, 4}. Recente vooruitgang in de in vitro generatie van cellen van de alvleesklier β bootsen de generatie van de β-cellen in menselijke volwassene, en deze cellen Toon therapeutische werking na implantatie in diabetische model muizen^2,3. Bovendien, bleek het onderzoek van de β-cellen gegenereerd op basis van de geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van gezonde en type 1 diabetes patiënt donoren geen functionele verschillen waaronder wanneer stress⁵. Ziekte fenotypen hebben bovendien gedeeltelijk weergegeven in geïnduceerde pancreatic cellen met patiënt afkomstige iPSCs of hPSCs herbergen genetische mutaties in dezelfde site als de patiënten^6,7.

Voor het genereren van pancreatic cellen uit hPSCs, wordt stapsgewijze gestuurde differentiatie die ontwikkelings processen recapituleert gebruikt. De alvleesklier is afgeleid van de endoderm laag van het vroege embryo, die spreekt van geslacht bepalen regio Y-vak 17 (SOX17) en forkhead vak A2 (FOXA2)⁸. Op basis van de studies van de muis, vormt de endodermal laag de primitieve gut buis, die wordt gekenmerkt door de uitdrukking van de hepatocyte nucleaire factor 1-beta (Hnf1β) en hepatocyte nucleaire factor 4-alpha (Hnf4α). De primitieve gut buis kieuwopeningenvorm en ontwikkelt zich tot de respiratoire toestellen, maagdarmkanaal en organen. Na de rek, de achterste voordarm gebied wordt de vermoedelijke alvleesklier regio, zoals aangegeven door de expressie van het transcriptionele factor alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1 (PDX1)^8,–^9,10. De dorsale en ventrale delen van de PDX1⁺ gut buis dikker aan formulier alvleesklier toppen, die worden gekenmerkt door de co uitdrukking van alvleesklier transcriptie factor 1 subeenheid alpha (PTF1A) en NK6 homeobox 1 (NKX6.1)^8,11. Deze expressie is de morfologische begin van alvleesklier organogenese. Alvleesklier endoderm cellen, die onderdelen van de alvleesklier toppen, vormen een vertakte buisvormige netwerk van epitheliale structuren¹² en uiteindelijk in exocrine en endocriene cellen, met inbegrip van de β-cellen insuline-afscheidende onderscheiden en glucagon-afscheidende α-cellen. Uitdrukking van PDX1 wordt eerst gedetecteerd bij de vermoedelijke alvleesklier regio, die vervolgens wordt waargenomen gedurende de gehele ontwikkeling van de alvleesklier, en toont localization voor β – en δ-cellen^9,13,14. Hoewel de Pdx1⁺ cel gebied dat doet niet express Ptf1a of Nkx6.1 onderscheidt in het antrum maag, twaalfvingerige darm, extrahepatic gal duct en sommige intestinale cellen in de midden tot late stadium van ontwikkeling in muizen⁹, PDX1⁺ cellen worden beschouwd als van de progenitoren van de alvleesklier de vroeg developmental stadium bij de mens.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van hPSCs in PDX1⁺ cellen voor de generatie van de alvleesklier geslachten. Het protocol initieert differentiatie door zaaien losgekoppeld afzonderlijke cellen^15,16,17. In het algemeen, ongedifferentieerde hPSCs worden onderhouden als kolonies of cel aggregaten in suspensie of in hechting. Dientengevolge, starten de meeste protocollen de differentiatie kort na passaging. Echter, in de Braziliaanse deelstaat kolonies of geaggregeerd, cellen zijn gevoelig voor ruimtelijke en transcriptionele heterogeniteiten^{18,19,20,21,22}, die zouden kunnen belemmeren de eerste stap van de differentiatie naar definitieve endoderm gevolgd door inefficiënte differentiatie naar PDX1⁺ cellen. Dit protocol kan bieden gemakkelijk te hanteren om te verbeteren en stabiliseren van de efficiëntie van de differentiatie van hPSC regels die eerder werden gevonden om te differentiëren inefficiënt aan endodermal geslachten en PDX1⁺ cellen^{23, 24 , 25}.