Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma
概要
Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA’ların veya transcriptome mRNA’ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.
Abstract
Uygun protein ifade doğru zamanda ve doğru miktarda normal hücre işlevi ve hızla değişen bir ortamda hayatta kalma temeli budur. Uzun süre, gen ifade çalışmalar araştırma transkripsiyon düzeyde hakim. Ancak, mRNA’ların kararlı durum düzeyleri de protein üretimi ile ilişkilendirmek değil ve mRNA’ların translatability büyük ölçüde koşullarına göre değişiklik gösterebilir. LEISHMANIA, parazit gibi bazı organizmalarda protein ifade çoğunlukla translasyonel düzeyinde düzenlenmiştir. Son çalışmalar bu protein çeviri bozukluk kanser, metabolik, nörodejeneratif ve diğer insan hastalıkları ile ilişkili olduğunu gösterdi. Polysome profil oluşturma protein çeviri düzenleme eğitim için güçlü bir yöntemdir. Bu çeviri bir genom geniş ölçekte incelemek veya bireysel mRNA’ların translasyonel durumunu ölçmek için sağlar. Bu teknik polizomlar, ribozom, onların alt birimleri ve ücretsiz mRNA’ların sırasında Santrifüjü bir sitoplazmik, sukroz degrade lysate ayrılması temelidir. Burada, üç farklı modellerde – kullanılan bir evrensel polysome profil oluşturma iletişim kuralı parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve hayvan dokuları mevcut. LEISHMANIA hücrelerin serbestçe süspansiyon büyümesine ve fare testis bir hayvan doku örneği temsil ederken kültürlü insan hücreleri yapisan monolayer içinde büyür. Böylece, bu kaynakların tümüne adapte bir tekniktir. Protokolü polysomal kesirler analizi için algılama düzeylerinin bireysel mRNA tarafından RT-qPCR, proteinler tarafından Western blot ve Elektroforez tarafından ribozomal RNA’ların analizini içerir. Yöntemi daha da derin RNA-seq tarafından transcriptome düzeyde bir ribozom mRNA’ların ilişkilendirmesiyle incelenmesi ve analiz ribozom ilişkili proteinlerin tarafından kesirler kütle spektroskopisi tarafından uzatılabilir. Yöntem diğer biyolojik modelleri kolaylıkla ayarlanabilir.
Introduction
Hücrelerde gen ifadesinin düzenlenmesi transkripsiyon, posttranscriptional ve ardından mekanizmaları tarafından kontrol edilir. Derin RNA sıralama gelişmeler genom geniş ölçekli bir benzeri görülmemiş düzeyde kararlı durum mRNA düzeylerinin çalışma izin. Ancak son bulgular kararlı durum mRNA düzeyi her zaman protein üretim1,2ile ilişkilendirmek değil ortaya. Bireysel bir transkript kaderi çok karmaşıktır ve iç/dış uyaranlara, stres, vbgibi birçok faktöre bağlıdır. Protein sentezi sırasında gen ifade Yönetmeliği ifade kontrol değişen koşullarına hızlı bir yanıt için gerekli bir başka bir katmanı sağlar. Polysome (ya da “polyribosome”) profil oluşturma, ayrılık ve görselleştirme aktif ribozomlar, çeviri tür protein sentezi ile çalışmak için güçlü bir yöntemdir. Rağmen ilk deneysel uygulamaları 1960’larda3‘ te çıktı, polysome profil oluşturma şu anda en önemli teknikler protein çeviri çalışmaları4biridir. Tek mRNA’ların bir polysome oluşumu için önde gelen birden fazla ribozom tarafından tercüme edilebilir. Transkript ribozomlara sikloheksimit5 üzerinde durdu ve mRNA’ların polizomlar farklı numaralar içeren polysome ayırma sürecinde Sükroz degrade ultrasantrifüj6,7 tarafından ayrılabilir , 8 , 9. polysomal kesirler RNA analiz sonra genom geniş ölçekte ve farklı fizyolojik şartlarda4,7, sırasında değişiklik translasyonel bireysel mRNA’ların durumlarında ölçüm sağlar 10. yöntem da kullanılmıştır 5′ UTR ve 3′ UTR serilerinde mRNA translatability11kontrolünü rollerini ortaya çıkarmak, miRNAs translasyonel baskı12rolünü incelemek, ribozom biyongenezi13 kusurları ortaya çıkarmak için ve ribozom ilişkili proteinler ile insan hastalıkları14,15rolünü anlamak. Son on yılda, büyüyen bir rol için çeviri sırasında gen ifade Yönetmeliği insan hastalıkları önemini gösteren ortaya çıkmıştır. Kanser, metabolik translasyonel denetiminde ve nörodejeneratif hastalıklar için kanıt ezici15,16,17,18‘ dir. Örneğin, bozukluk eIF4E bağımlı translasyonel denetiminin katkıda otizm ile ilgili açıkları15 ve FMRP, ribozom mRNA’ların otizm14‘ e bağlı üzerinde durdurduklarını ilgilenmektedir. Böylece, polysomal profil oluşturma birden çok insan hastalıkları translasyonel yönetmelikte hataları incelemek için çok önemli bir araçtır.
Protein analizi farklı fizyolojik koşullar altında polysomal kesirler çeviri sırasında ribozomlar ile ilişkili faktörler fonksiyonunun olduğu inceliyor. Maya, memeli hücreleri, bitkiler ve tek hücreli10,19,20,21de dahil olmak üzere birçok canlı türünün polysome profil çıkarma tekniği kullanılmıştır. Protozoon parazitler Trypanosoma ve LEISHMANIA gibi gen ekspresyonu sınırlı transkripsiyon kontrolü sergi. Onların genleri organizatörü düzenlenir transkripsiyon22eksikliği polycistronic gen kümeler halinde düzenlenir. Bunun yerine, gelişimsel gen ekspresyonu ağırlıklı olarak protein çeviri ve mRNA istikrar trypanosomatid türler23,24düzeyinde kontrol edilir. Bu nedenle, transkripsiyon yönetmelik yokluğunda translasyonel kontrol anlayışı bu organizmalar için özellikle önemlidir. Polysomal profil oluşturma posttranscriptional düzenleme LEISHMANIA25,26,27,28gen ifadesinde, eğitim için güçlü bir araçtır.
Bireysel mRNA’ların düzeyleri gerçek tarafından algılanması son sürüyor kantitatif PCR (RT-qPCR) ve yeni nesil sıralama yanı sıra proteomik teknolojileri tarafından tam transcriptome zaman, çözünürlük ve polysomal yeni bir seviyeye profil oluşturma avantajlarını getiriyor. Bu yöntemlerin kullanımı daha da derin RNA sıralama hücreleri bir genom geniş ölçekte translasyonel durumunu izlemek için proteomik analizi ile birlikte bireysel polysomal kesirler analizi ile genişletilebilir. Bu çeviri farklı fizyolojik ve patolojik şartlar altında düzenleyen yeni moleküler oyuncular tanımlamasını sağlar. Burada, üç farklı modellerde kullanılan iletişim kuralı profil oluşturma bir evrensel polysome mevcut: parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve hayvan dokuları. Biz mevcut tavsiye farklı organizmalar, degrade koşullardan optimizasyonu, seçim RNase inhibitörleri ve RT-qPCR, Western blot ve RNA Elektroforez polysome kesirler bu çalışmada analiz etmek için uygulama üzerinden cep lysates hazırlanması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysome ayırma Sükroz degrade tarafından RNA ile kombine ve kesirler protein analizi bireysel mRNA’ların veya tüm translatome translasyonel durumunu yanı sıra translasyonel düzenleyen protein etkenler rolleri analiz etmek için güçlü bir yöntemdir makine normal fizyolojik veya hastalık durumu sırasında. Polysomal profil oluşturma nerede transkripsiyon kontrolü büyük ölçüde yoktur ve gen ifade düzenlemesi çoğunlukla oluşur LEISHMANIA de dahil olmak üzere trypanosomatids gibi organizmal…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Ching Lee ses kaydı ile yardım için teşekkür. Araştırma Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Start-up fonlarından desteklenen bir durumdu ve Center of Excellence translasyonel Neuroscience ve tedavi (CTNT) tarafından PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K. için vermek; NIH grant tarafından kısmen K.Z. James C. Huffman ve Kristen R. Baca R01AI099380 CISER (kök Tümleştirme eğitim ve Araştırma Merkezi) bilim adamları vardı ve program tarafından desteklenen edildi.
Materials
| Instruments: | ||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B |
| Software | ||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | |
| Materials: | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 |
| Chemicals: | ||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 |
| Water | Sigma | W4502-1L |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
参考文献
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
- Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
- Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
- Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5′ UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
- Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
- Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
- Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
- Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
- De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
- Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
- De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
- Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
- McNicoll, F., et al. Distinct 3 ‘-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
- Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 ‘-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
- Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).
- Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
- Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
