Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

בקרת גנים בתאים נשלטת על ידי גנים ברמת השעתוק, posttranscriptional ו- posttranslational. ההתקדמות רצף הרנ א עמוק לאפשר המחקר של מצב יציב רמות ה-mRNA בקנה מידה הגנום כולו ברמה חסרת תקדים. עם זאת, הממצאים האחרונים גילה כי רמת ה-mRNA מצב יציב לא תמיד לתאם עם חלבון ייצור^1,2. גורלו של התעתיק בודדים מורכב מאוד, תלוי בגורמים רבים כמו גירויים פנימי/חיצוני, הלחץ, וכו ‘. בקרת גנים במהלך סינתזת החלבון מספק שכבה נוספת של בקרת ביטוי הכרחי לתגובה מהירה בשינוי תנאי. Polysome (או “polyribosome”) שימוש בפרופילים, את ההפרדה והדמיה של פעיל תרגום הריבוזומים, היא שיטה חזקה ללמוד ברגולציה של סינתזת החלבון. למרות, יישומים ניסיוני הראשון שלו הופיע של שנות ה-60³, פרופיל polysome נחשב כיום לאחד הטכניקות החשובות חלבון תרגום מחקרים⁴. MRNAs יחיד יכול להיות מתורגם על ידי אחד או יותר ריבוזום שמוביל היווצרות polysome. תעתיקים יכול להיות התעכב על הריבוזומים עם cycloheximide⁵ ו mRNAs המכיל מספר שונה של polysomes ניתן להפריד בתהליך polysome fractionation על ידי סוכרוז הדרגתיות ultracentrifugation^{6,7 , 8 , 9}. ניתוח RNA של שברים polysomal מכן מאפשרת מדידה של שינויים בארצות translational של הפרט mRNAs בקנה מידה הגנום כולו, ובמהלך מצבים פיזיולוגיים שונים^{4,7, 10}. השיטה שימש גם כדי לחשוף את התפקידים של 5′ UTR, 3′ UTR רצפי הבקרה של ה-mRNA translatability¹¹, לבחון את תפקיד miRNAs דיכוי translational¹², שמתוכננות לגלות פגמים בריבוזום להן¹³ , ולהבין את התפקיד של הריבוזום-הקשורים חלבונים עם מחלות אנושיות^14,15. במהלך העשור האחרון, תפקיד גדל והולך עבור בקרת גנים במהלך התרגום התפתחה הממחיש את חשיבותו של מחלות אנושיות. העדויות על בקרה translational ב סרטן, מטבוליות, מחלות ניווניות הוא המכריע^15,16,17,18. לדוגמה, dysregulation של שליטה translational תלויי-eIF4E תורמת אוטיזם הקשורים גירעונות¹⁵ ו- FMRP מעורב השתהות של הריבוזומים על mRNAs קשורה לאוטיזם¹⁴. לפיכך, פרופיל polysomal הוא כלי מאוד חשוב ללמוד פגמים בתקנה translational מחלות אנושיות מרובות.

אנליזת חלבונים שברים polysomal בתנאים פיזיולוגיים שונים מבתר את הפונקציה של גורמים הקשורים הריבוזומים במהלך התרגום. הטכניקה פרופיל polysome שימש במינים רבים, לרבות שמרים בתרבית של תאים, צמחים, חד-תאיים^10,19,20,21. טפילים protozoan כמו Trypanosoma ולישמניה להפגין שליטה מוגבלת תעתיק של ביטוי גנים. הגנום שלהם מאורגנות אשכולות גנים polycistronic חסרי שעתוק מקדם מוסדר²². במקום זאת, ביטוי גנים התפתחותית נשלטת בעיקר ברמה של חלבון תרגום ויציבות mRNA trypanosomatid מינים^23,24. לכן, הבנה של שליטה translational בהעדר רגולציה תעתיק זה חשוב במיוחד עבור אורגניזמים אלה. פרופיל polysomal הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד posttranscriptional בקרת גנים לישמניה^25,26,27,28.

התקדמות האחרונות בזיהוי של רמות mRNAs בודדים על-ידי אמת בפעם ה-PCR כמותי (RT-qPCR), transcriptome מלאה על ידי רצף הדור הבא, כמו גם טכנולוגיות פרוטאומיקס, מביא את הרזולוציה ואת היתרונות של פרופיל polysomal לרמה חדשה. השימוש בשיטות אלה ניתן להרחיב הלאה על ידי רצף הרנ א עמוק בשילוב עם ניתוח פרוטיאומיה מבנית כדי לפקח על מצב translational של תאים בקנה מידה הגנום כולו על ידי ניתוח של שברים polysomal בודדים. דבר זה מאפשר זיהוי שחקנים מולקולריים חדשים ויסות תרגום בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן, אנו מציגים polysome האוניברסלית של פרופיל פרוטוקול המשמש על שלושה דגמים שונים: טפיל לישמניה הגדולות, בתרבית תאים אנושיים, רקמות חיות. אנו מציגים את העצה על הכנת תא lysates אורגניזמים שונים, אופטימיזציה של תנאי מעבר צבע, הבחירה של מעכבי RNase ויישום של RT-qPCR, תספיג ו RNA אלקטרופורזה לנתח שברים polysome במחקר זה.