Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

Régulation de l’expression de gène dans les cellules est contrôlée par des mécanismes transcriptionnels, post-transcriptionnel et post-traductionnelle. Les progrès dans le séquençage en profondeur RNA permettent l’étude des niveaux d’ARNm stationnaire sur une échelle de tout le génome à un niveau sans précédent. Cependant, les découvertes récentes ont révélé que d’ARNm stationnaire n’est pas toujours corrélée avec la production de protéine^1,2. Le sort d’un relevé de notes individuel est très complex et dépend de nombreux facteurs comme des stimuli internes/externes, stress, etc.. Régulation de l’expression génique au cours de la synthèse des protéines fournit une autre couche de contrôle d’expression nécessaire pour une réponse rapide dans des conditions changeantes. Polysome (ou « polyribosomique »), le profilage, la séparation et la visualisation de traduire activement des ribosomes, est une méthode puissante pour étudier la régulation de la synthèse protéique. Bien que, ses premières applications expérimentales est apparu dans les années 1960³, polysome profilage est actuellement une des techniques plus importants en protéines translation studies⁴. Seul ARNm peut se traduire par plus d’un ribosome conduisant à la formation d’un polysome. Relevés de notes peuvent être calés sur les ribosomes avec cycloheximide⁵ et ARNm contenant des nombres différents de polysomes se distingue dans le processus de fractionnement polysome de saccharose ultracentrifugation dégradé^{6,7 , 8 , 9}. l’analyse des fractions polysomique RNA puis permet de mesurer des changements dans les États translationnelles de différents mRNAs à l’échelle du génome et au cours de différentes conditions physiologiques^{4,7, 10}. la méthode a été également utilisée pour révéler les rôles de 5′ UTR et 3′ UTR des séquences dans le contrôle de l’ARNm traduisibilité¹¹, examiner le rôle des miARN dans la répression traductionnelle¹², découvrir des défauts dans la biogenèse des ribosomes¹³ et comprendre le rôle des protéines associées aux ribosomes avec des maladies humaines^14,15. Au cours de la dernière décennie, un rôle croissant pour la régulation de l’expression génique au cours de la traduction a émergé qui illustre son importance dans les maladies humaines. Les éléments de preuve pour le contrôle de la traduction dans le cancer, métabolique et maladies neurodégénératives est écrasante^15,16,17,18. Par exemple, le dérèglement du contrôle de la traduction eIF4E dépendant contribue à autisme associés déficits¹⁵ et FMRP participe au blocage des ribosomes sur mRNA liés à l’autisme,¹⁴. Ainsi, polysomique de profilage est un outil très important pour l’étude des défauts de régulation traductionnelle dans plusieurs maladies humaines.

Analyse des protéines des fractions polysomique dans différentes conditions physiologiques dissèque la fonction des facteurs associés aux ribosomes pendant la traduction. La technique de profilage polysome a été utilisée dans de nombreuses espèces, y compris les levures, les cellules de mammifères, plantes et protozoaires^10,19,20,21. Parasites protozoaires comme Trypanosoma et Leishmania pièce contrôle transcriptionnel limité de l’expression génique. Leurs génomes sont organisés en groupes de gènes polycistronique qui n’ont pas réglementés promoteur de transcription²². Au lieu de cela, l’expression des gènes du développement est surtout contrôlée au niveau de la traduction des protéines et à la stabilité des ARNm dans trypanosomatide espèce^23,24. Compréhension du contrôle de la traduction en l’absence de régulation de la transcription est donc particulièrement importante pour ces organismes. Polysomique de profilage est un outil puissant pour étudier la régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique à Leishmania^25,26,27,28.

Les récents progrès dans la détection des niveaux d’ARNm individuels par le real time PCR quantitative (RT-qPCR) et pleine transcriptome par séquençage de nouvelle génération, ainsi que technologies de protéomique, apporte la résolution et les avantages du profilage polysomique à un nouveau niveau. L’utilisation de ces méthodes peut être étendue par l’analyse des différentes fractions polysomique par séquençage en RNA profondeur combiné à l’analyse protéomique pour surveiller l’État translationnelle de cellules sur une échelle de tout le génome. Cela permet l’identification de nouveaux acteurs moléculaires régissant la traduction dans différentes conditions physiologiques et pathologiques. Nous présentons ici un polysome universel profilage protocole utilisé sur trois modèles différents : le parasite Leishmania majeur, des cellules humaines cultivées et tissus d’origine animales. Nous présentons des conseils sur la préparation des lysats de cellules de différents organismes, l’optimisation des conditions du gradient, choix des inhibiteurs de la RNase et l’application de la RT-qPCR, Western blot et électrophorèse RNA pour analyser les fractions de polysome dans cette étude.