在利什曼原虫、人体细胞和小鼠睾丸中的 Polysome 分析

细胞基因表达调控由转录、转录后水平和翻译后机制控制。在深 RNA 测序方面的进展允许在一个空前的水平上研究基因组范围内的稳态 mRNA 水平。然而, 最近的研究发现, 稳态 mRNA 水平并不总是与蛋白质生产相关^1,2。一个单独的成绩单的命运是非常复杂的, 取决于许多因素, 如内部/外部刺激, 压力,等。在蛋白质合成过程中, 基因表达调控为在变化条件下快速反应提供了另一层表达控制。Polysome (或 “polyribosome”) 剖面分析, 积极翻译核糖体的分离和可视化, 是研究蛋白质合成调控的有力方法。虽然, 它的第一个实验应用出现在二十世纪六十年代³中, polysome 分析目前是蛋白质翻译研究⁴中最重要的技术之一。单基因可由多个核糖体转化导致形成 polysome。转录可以停滞在核糖体与放线菌酮5和基因包含不同数量的 polysomes 可以在 polysome 分馏过程中分离的蔗糖梯度离心 6, 7 ^,8,9. polysomal 分数的 RNA 分析然后允许测量基因组范围内单个基因的平移状态的变化, 在不同的生理条件下^4,7,10. 该方法还用于揭示 5 ‘ UTR 和 3 ‘ UTR 序列在 mRNA 可译性的控制中的作用¹¹, 检查 miRNAs 在平移抑制中的角色¹², 揭开核糖体合成^{13 的缺陷}, 并了解核糖体相关蛋白与人类疾病的作用^14,15。在过去的十年中, 在翻译过程中对基因表达调控的作用越来越大, 这说明了它在人类疾病中的重要性。在癌症、代谢和神经退行性疾病中进行平移控制的证据非常惊人^15,16,17,18。例如, eIF4E-dependent 平移控制的失调有助于自闭症相关的赤字¹⁵和 FMRP 参与停滞的核糖体基因链接到自闭症¹⁴。因此, polysomal 分析是研究多种人类疾病的翻译调节缺陷的重要工具。

不同生理条件下 polysomal 分数的蛋白质分析, 对翻译过程中核糖体相关因素的作用进行了剖析。polysome 分析技术已用于许多物种, 包括酵母, 哺乳动物细胞, 植物和原生动物^10,19,20,21。像锥和利什曼原虫这样的原生动物寄生虫表现出有限的基因表达转录控制。他们的基因组被组织成 polycistronic 基因簇, 缺乏启动子调控的转录²²。相反, 发展基因表达主要控制在蛋白质的翻译水平和 mRNA 稳定性的 trypanosomatid 物种^23,24。因此, 在缺乏转录调控的情况下理解平移控制对这些生物体尤为重要。Polysomal 分析是研究利什曼原虫^{25、26、27、28}中基因表达转录后水平调控的有力工具。

通过实时定量 PCR (RT-qPCR) 和转录的下一代测序以及蛋白质组学技术检测个体基因水平的最新进展, 将 polysomal 分析的解决方案和优势带到了一个新的层次。通过对单个 polysomal 分数的分析, 结合蛋白质组学分析的方法, 可以进一步扩大对各细胞的使用, 以监测整个基因型范围内体细胞的平移状态。这使得在不同的生理和病理条件下, 识别新的分子玩家调节翻译。在这里, 我们提出了一个通用的 polysome 分析协议, 用于三种不同的模型: 寄生虫利什曼原虫少校, 培养的人类细胞和动物组织。本文就不同生物体的细胞裂解物的制备、梯度条件的优化、RNase 抑制剂的选择、qPCR、印迹和 RNA 电泳等方面的应用提出建议, 以分析 polysome 分数。