概要

用斑点印迹分析 A11-positive β淀粉样寡聚物的制备与评价

Published: May 22, 2018
doi:

概要

本协议描述如何从合成肽体外制备 Aβ寡聚物, 并通过斑点印迹分析来评价 Aβ的相对含量。

Abstract

β淀粉样蛋白 (Aβ) 是一种疏水性肽, 具有自组装成骨料的内在倾向。在各种团聚体中, Aβ寡聚物作为阿尔茨海默病 (ad) 进展的主要神经毒素被广泛接受, 被认为是 ad 发病的关键事件。因此, Aβ寡聚物抑制剂可以防止变性, 并有潜力发展为疾病修改治疗的 AD。然而, Aβ寡聚物的不同形成方案可能会导致不同特征的寡聚。此外, 有效筛选 Aβ1-42寡聚物抑制剂的方法也不多。A11 抗体可以与含有反平行β片结构的毒性 Aβ1-42齐聚物的子集发生反应。在本协议中, 我们描述了如何从 Aβ的合成 Aβ1-42的体外准备一个 A11-positive 的1-42富齐聚的样本, 并通过斑点印迹来评估样本中 A11-positive Aβ1-42齐聚物的相对数量使用 A11 和 Aβ1-42特定6E10 抗体进行分析。使用该协议, A11-positive Aβ1-42齐聚物的抑制剂也可以从半定量实验结果中筛选出来。

Introduction

阿尔茨海默病 (AD) 是影响全球老年人的最重要的神经退行性疾病之一1。普遍认为β淀粉样蛋白 (Aβ) 的异常聚集可能是 AD 的主要病理因子。Aβ骨料是老年斑块的主要成分, 是 AD 患者大脑中的生物学标志物之一。此外, Aβ聚集物, 特别是寡聚物, 产生强大的神经毒性, 这可能是导致神经元死亡的原因。因此, 抑制 Aβ寡聚物的形成可以防止变性, Aβ寡聚物抑制剂可作为 AD 的病害修饰处理。许多研究使用合成 Aβ肽在体外形成寡聚物, 探讨人工 Aβ寡聚的形貌和结构, 并利用体外模型2,3对 Aβ寡聚物的抑制剂进行研究。,4. 然而, 不同的体外形成协议的 Aβ寡聚物可能导致不同形态特征的聚类, 这可能导致不同研究组之间的不可比拟的结果。因此, 迫切需要一种标准的 Aβ齐聚物生成协议。

到目前为止, 还没有多少方法可以直接检测 Aβ寡聚物。透射电镜 (TEM)、非变性凝胶电泳、酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和斑点印迹分析可用于检测 Aβ寡聚物的数量和/或形态学体外5,6. 例如, Aβ齐聚物的形态和结构可以在 TEM 中观察到。用非变性凝胶电泳法测定 Aβ聚合的相对含量和分子量。ELISA 可用于测定血清、血浆和脑组织提取物中的 Aβ寡聚体。最后, 斑点印迹分析, 一种用于检测、分析和识别蛋白质的技术, 可用于评价不同样品中 Aβ齐聚物的相对浓度, 并借助于寡聚特异性和 Aβ特异抗体。此外, 斑点印迹检测提供了大量的时间节省, 因为凝胶电泳和印迹程序的凝胶是不需要的。因此, 这种检测通常用于筛查潜在的 Aβ寡聚物抑制剂。本协议的总体目标是描述一种相对简单、可靠且可重现的方法, 用于准备 Aβ1-42富聚物的样本, 通过斑点印迹分析来分析 Aβ1-42低聚物的数量, 并筛选 Aβ寡聚使用半定量实验结果的抑制剂。

Protocol

1. 解决方案准备 注: 有关试剂来源, 请参阅材料表。 在100毫升的双蒸馏水中加入5克 bsa, 制备5% 牛血清白蛋白 (bsa) 溶液。涡流他们完全混合。将解决方案存储在摄氏4摄氏度, 最多1月。 在 5% BSA 溶液的10毫升中加入10µL 抗体储存液, 制备抗低聚物抗体 A11 溶液 (1:1, 000)。涡流他们完全混合。将解决方案存储在摄氏4摄氏度, 最多1月。 在10毫升 5% BSA…

Representative Results

为研究 Aβ1-42单体在制备后是否能形成 Aβ1-42齐聚物, 采用 TEM 分析。在 HFIP 溶解 Aβ1-42单体样本中未观察到可见骨料 (图 1A)。此外, 在48小时的震动后, 在 Aβ1-42样本中观察到了直径约 10-80 nm 的球状骨料, 这表明 Aβ1-42在准备后形成寡聚 (图 1B)。 <p class="jove_content…

Discussion

在本协议中, 我们报告了一种方法, 用于准备包含 Aβ1-42低聚物的样本, 并通过斑点印迹分析来分析 A11-positive Aβ1-42寡聚的数量。虽然我们的制备 Aβ1-42富聚物样品的方法非常简单、可靠、重现性好, 但仍有一些值得注意的点。首先, HFIP 用于溶解合成 Aβ1-42肽。聚合 Aβ1-42肽可以在 HFIP 溶液中分解成单体。但是, HFIP 容易挥发, HFIP 的粘度很低。因此, Aβ1-42</s…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了中国国家自然科学基金 (U1503223, 81673407, 21475131) 的资助, 浙江省非营利技术应用研究项目 (2016C37110), 宁波国际科技合作项目 (2014D10019)、宁波市生命科学与健康创新团队 (2015C110026)、宁波市科技 & 科技项目共同财富 (2017C50042)、李家和业杨厝港钦利海洋生物制药发展基金,宁波大学的肯塔基州金麦格纳基金。

Materials

A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) Abcam GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) Cell Signalling Technology 2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) Millipore AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)  Beyotime A0208
1-42 GL Biochem 52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol Aladdin I1523078
Curcumin Sigma C1386
Albumin Bovine V Solarbio A8020
Sodium chloride Sangon Biotech D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate SCR 30166428
TRIS Solarbio T8060
Glycine Solarbio G8200
 Dimethyl sulfoxide Solarbio D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker Beyotime P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE Genshare JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane Pall Corporation T50189
Methanol SCR 10014118
Ethanol SCR 10009218
Super low range protein Marker Solarbio PR1300
Transfer Membranes Immobilon-PSQ ISEQ00010
BeyoECL Star Beyotime P0018A
Commassie Blue Fast staining solution Beyotime P0017
All – automatic chemiluminescence imaging system Tanon Tanon 5200
Image J National Institutes of Health (NIH)
Image processing software Adobe Photoshop CS6
Magnetic agitator Shanghai Huxi

参考文献

  1. Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
  2. De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).
  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer’s beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. 生化学. 53 (28), 4489-4502 (2014).
  4. Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
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  7. Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer’s A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
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記事を引用
Chunhui, H., Dilin, X., Ke, Z., Jieyi, S., Sicheng, Y., Dapeng, W., Qinwen, W., Wei, C. A11-positive β-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57592, doi:10.3791/57592 (2018).

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