루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

역동적이 고 복잡 한 미생물 지역 사회 박테리아, archaea, 바이러스, 곰 팡이, 그리고 다른 진 핵 미생물의 구성 식물 관련 된 microbiomes에 의하여 이루어져 있다. 식물 질병의 원인에 그들의 잘 공부 역할, 식물 관련 미생물도 긍정적인 영향을 미칠 수 식물 건강 biotic 및 abiotic 스트레스에 내성 개선 하 고, 양분 가용성, 홍보 강화 통해 식물 성장 여 phytohormones의 생산입니다. 이러한 이유로, 특정 관심 taxa 식물 루트 endospheres, rhizospheres, 및 주위 토양 연관 특성화에 존재 합니다. 일부 미생물 실험실 생성 된 미디어에 고립에서 경작 될 수 있다, 하는 동안 많은 수 없습니다, 그들은 다른 미생물과 공생 관계에 따라 달라질 수 있기 때문에 일부 매우 느리게 성장 또는 랩 환경에서 복제 될 수 없는 조건을 요구. 때문에 재배에 대 한 필요를 circumvents 상대적으로 저렴 하 고 높은 처리량, 되었다 환경 및 호스트 관련 미생물 샘플 프로 파일링 계통 발생 시퀀스 기반 미생물 커뮤니티 시 금 선호 하는 방법 구성입니다.

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼¹ 다양 한에서 제공 하는 적절 한 시퀀싱 기술의 선택은 사용자의 요구에 따라 포함 하는 중요 한 요소: 원하는 범위, amplicon 길이, 예상 커뮤니티 다양성, 뿐만 아니라 오류 속도, 읽기-길이, 그리고는 비용-당-실행/megabase 시퀀싱. Amplicon 기반 시퀀싱 실험에서 고려 되어야 또 다른 변수 어떤 유전자 증폭 될 것 이며 어떤 뇌관을 사용 됩니다. 때 설계 또는 뇌관을 선택, 연구 결과 amplicons에서 달성 증폭의 보편성과 분류학 해상도 간의 절충이 종종 밖에 없습니다. 이러한 이유로 이러한 유형의 연구는 자주 뇌관 및 마커는 미생물의 특정 하위 집합을 대상으로 선택적으로 선택 했다. 세균성 지역 사회 구성 평가 연속 하나 이상의 세균의 16S rRNA 유전자^2,3의 하이퍼 지역 일반적으로 수행 됩니다. 이 연구에서 설명 하는 기반 하는 amplicon 시퀀싱 프로토콜 NGS 플랫폼에 대 한 충분 한 다양성을 제공 하는 동안 세균 taxa의 넓은 확대를 위한 수 있는 세균의 16S rRNA 유전자의 그 대상 500 bp V3-V4 지역 개발 다른 taxa 사이 구별. 또한,이 프로토콜을 쉽게 다른 뇌관 집합, 버섯의 ITS2 마커 나 진핵생물의 18S rRNA 소 단위를 대상으로 함께 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.

다른 접근 같은 샷건 metagenomics, metatranscriptomics, 및 단일 셀 시퀀싱, 이점이 다른 해결된 미생물 게놈 및 커뮤니티 기능의 더 직접적인 측정을 포함 하 여, 이러한 기술은 일반적으로 더는 비싸고 계통 발생 프로 파일링 보다 계산 집중⁴여기 설명합니다. 또한, 루트 샘플에 샷건 metagenomics 및 metatranscriptomics을 수행 호스트 식물 게놈에 속하는 읽기의 큰 비율 수 있고이 한계를 극복 하는 방법을 여전히 개발된^5,6되 고 있습니다.

어떤 실험 플랫폼와 마찬가지로 amplicon 기반 프로 파일링 하는 것은 실험적인 디자인 및 데이터 분석 하는 동안 고려 되어야 하는 잠재적인 편견의 수를 발생할 수 있습니다. 샘플 수집, DNA 추출, PCR 뇌관의 선택 및 라이브러리 준비를 수행 하는 방법을 방법을 포함 됩니다. 다른 방법을 생성 하 고, 사용 가능한 데이터의 양을 크게 영향을 미칠 수 고 또한 연구 사이 결과 비교 하는 노력을 방해 수 있습니다. 예를 들어 rhizosphere 박테리아⁷ 와 다른 추출 기술의 사용 또는 DNA 추출 키트^8,9 의 선택 제거 하는 방법 표시 되었습니다 크게 영향을 다운스트림 분석에 이르게 이 관한 미생물은 현재와 그들의 상대 나타났는데 되는 다른 결론 프로 파일링 amplicon 기반 사용자 지정할 수 있습니다, 이후 연구에서 비교를 만드는 전하실 수 있습니다. 지구 Microbiome 프로젝트 공장 관련 미생물 같은 복잡 한 시스템을 공부 하는 연구자의 응용 프로그램에 의해 발생 하는 변화를 최소화 하는 수단으로 표준화 된 프로토콜의 개발에서 도움이 될 것 이라고 제안 했다 연구^10,11사이 다른 방법. 여기, 우리가 위의 주제의 대부분을 토론 하 고 어디 유용한 제안을 제공 적절 한.

프로토콜 색 사탕수수 에서 추출 DNA 기초가 DNA 분리 키트¹¹를 사용 하 여 수집, rhizosphere, 토양과 루트 샘플 과정을 보여 줍니다. 또한, 우리의 프로토콜 세균성 지역 사회^12,,1314의 구조를 결정 하는 일반적으로 이용한 NGS 플랫폼을 사용 하 여 자세한 amplicon 시퀀싱 워크플로 포함 합니다. 이 프로토콜 식물 뿌리, rhizosphere, 및 사탕수수 색, 지 시 메이 스, 그리고 Triticum aestivum¹⁵를 포함 하 여 18 monocot 종의 관련 된 토양의 최근 출판된 연구에 호스트의 넓은 범위에서 사용에 대 한 확인 되었습니다. 이 메서드는 또한 검증 된 다른 마커 유전자와 함께 사용 하기 위해 agave 미생물^16,17 및 딸기 미생물 ^{의 연구에 곰 팡이 ITS2 마커 유전자를 공부 하 고 그것의 성공적인 응용 프로그램에서와 같이 18}.