Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

Microbiomi pianta-collegato è costituito da comunità microbiche dinamica e complessa, costituita da batteri, archaea, virus, funghi e altri microrganismi eucarioti. Oltre al loro ruolo ben studiata a causa di malattia delle piante, microbi pianta-collegato possono influenzare positivamente anche pianta salute migliorando la tolleranza agli stress biotici e abiotici, promuovendo la disponibilità di nutrienti, e migliorare la crescita delle piante attraverso la produzione di ormoni vegetali. Per questo motivo, particolare interesse esiste nel caratterizzare i taxa che associano con pianta radice endospheres, metodologie e il terreno circostante. Mentre alcuni microbi possono essere coltivate in isolamento il laboratorio multimediale generato, molti non possono, in parte perché essi possono si basano su relazioni simbiotiche con altri microbi, crescono molto lentamente, o richiedono condizioni che non possono essere replicate in un ambiente di laboratorio. Perché aggira la necessità per la coltivazione ed è relativamente poco costoso e ad alta velocità, analisi filogenetica basata su sequenza di campioni microbici ambientali e host-associato è diventata un metodo comodo per analizzante comunità microbica composizione.

La selezione delle tecnologie di sequenziamento appropriati forniti da vari prossima generazione sequenziamento (NGS) piattaforme¹ dipende dalla necessità degli utenti, con importanti fattori tra cui: copertura desiderata, lunghezza amplicon, previsto comunità diversità, come pure sequenziamento tasso di errore, la lettura-lunghezza e il costo-per-Esegui/megabase. Un’altra variabile che deve essere considerato in esperimenti di sequenziamento degli ampliconi è quale gene sarà amplificati e verrà utilizzato quale primer. Quando si progetta o scegliendo gli iniettori, i ricercatori spesso sono costretti a fare compromessi tra l’universalità dell’amplificazione e la risoluzione tassonomica ottenibile dagli ampliconi risultanti. Per questo motivo, questi tipi di studi scelto spesso primer e marcatori che mirare selettivamente specifici sottoinsiemi del microbioma. Valutare la composizione delle comunità batteriche avviene comunemente ordinando uno o più delle regioni ipervariabili del batterici 16S rRNA gene^2,3. In questo studio, descriviamo un amplicone basato sequenziamento protocollo sviluppato per una piattaforma NGS quella regione di bp V3-V4 obiettivi la 500 del gene del rRNA 16S batterica, che consente ampia amplificazione dei taxa batterici, fornendo inoltre una sufficiente variabilità a distinguere tra diversi taxa. Inoltre, questo protocollo può essere facilmente adattato per l’uso con altri set di primer, come quelli targeting il marcatore ITS2 di funghi o la subunità di rRNA 18S degli eucarioti.

Mentre altri approcci come fucile metagenomica, metatranscriptomics e sequenziamento unicellulare, offrono altri vantaggi tra cui risolti genomi microbici e misura più diretta della funzione di comunità, queste tecniche sono in genere più costoso e computazionalmente intensivi rispetto del profilo filogenetico descritto qui⁴. Inoltre, eseguendo il fucile metagenomica e metatranscriptomics su campioni di radice produce una grande percentuale di letture appartenendo a genoma della pianta ospite e metodi per superare questa limitazione sono ancora in fase sviluppato^5,6.

Come con qualsiasi piattaforma sperimentale, profiling basato su amplicone può introdurre un numero di potenziali pregiudizi che dovrebbe essere considerato durante l’analisi di dati di progettazione e sperimentale. Questi includono i metodi di raccolta dei campioni, DNA estrazione, selezione degli iniettori di PCR e come preparazione di libreria viene eseguita. Diversi metodi possono influenzare notevolmente la quantità di dati utilizzabili generati e possono anche ostacolare gli sforzi per confrontare i risultati tra gli studi. Ad esempio, il metodo di rimozione rizosfera batteri⁷ e l’uso di tecniche di estrazione diversa o scelta di DNA estrazione Kit^8,9 sono stati indicati per avere un impatto significativo dell’analisi a valle, che conduce a conclusioni differenti per quanto riguarda cui i microbi sono presenti e loro abbondanza relativa. Poiché profiling basato su amplicone può essere personalizzato, fare paragoni tra gli studi può essere impegnativo. Il progetto microbioma terra ha suggerito che i ricercatori che studiano i sistemi complessi come il microbioma pianta-collegato trarrebbero beneficio dallo sviluppo di protocolli standardizzati come mezzo per ridurre al minimo la variabilità causata dall’applicazione di metodi differenti tra studi^10,11. Qui, discutiamo molti degli argomenti di cui sopra e offrire suggerimenti per quanto riguarda le migliori pratiche dove opportuno.

Il protocollo viene illustrato il processo di raccolta del suolo, rizosfera ed esempi di radice da sorgo bicolore ed estrazione DNA usando una consolidata kit di isolamento del DNA¹¹. Inoltre, il nostro protocollo include un flusso di lavoro sequenziamento degli ampliconi dettagliate, utilizzando una piattaforma NGS comunemente utilizzata, per determinare la struttura delle comunità batteriche^12,13,14. Questo protocollo è stato convalidato per l’uso in una vasta gamma di ospiti della pianta in un recente studio pubblicato di radici, rizosfera e associati-terreni di 18 specie di monocot compreso Sorghum bicolor, Zea mays e Triticum aestivum¹⁵. Questo metodo è stato convalidato anche per l’utilizzo con altri geni marcatori, come dimostrato dalla sua riuscita applicazione allo studio del gene marcatore ITS2 fungo negli studi del agave microbiome^16,17 e fragola microbiome ¹⁸.