לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

צמח-הקשורים microbiomes מורכב דינאמי ומורכב קהילות מיקרוביאלית של חיידקים ארכאונים, וירוסים, פטריות, מיקרואורגניזמים אחרים האיקריוטים. בנוסף תפקידם למד היטב בגרימת מחלות צמחים, חיידקים הקשורים צמח יכול גם להשפיע לטובה על בריאות הצמח על ידי שיפור עמידות בפני לחצים ביוטיים, והאביוטיים קידום זמינות חומרי הזנה, שיפור צימוח דרך הייצור של phytohormones. מסיבה זו, קיים עניין מיוחד באפיון taxa מקשר עם הצמח שורש endospheres, rhizospheres את האדמה שמסביב. בעוד כמה חיידקים יכולים להיות בתרבית בבידוד במדיה שנוצר מעבדה, רבים לא ניתן, בין השאר כי הם עשויים מסתמכים על יחסי סימביוזה עם חיידקים אחרים, גדלים באיטיות, או דורשים תנאים שלא ניתן לשכפל בסביבת מעבדה. בגלל זה עוקף את הצורך בטיפוח והוא יחסית זול, תפוקה גבוהה, המבוססת על רצף פילוגנטי פרופיל של דגימות מיקרוביאלי סביבתיים הקשורים מארח הפכה שיטה מועדפות assaying קהילת חיידקים ההרכב.

הבחירה של טכנולוגיות רצף המתאימים שסופקו על-ידי שונים הדור הבא רצף פלטפורמות (הגדרות)¹ היא תלויה צורכי המשתמשים, עם גורמים חשובים כולל: כיסוי הרצוי, אורך אמפליקון, צפוי הקהילה גיוון, כמו גם קביעת רצף שיעור שגיאה באורך לקריאה, את העלות-לכל-ההפעלה/megabase. משתנה נוסף צריך להיחשב בניסויים מבוססי אמפליקון רצף הוא ג’ין מה הגברה מה תחל לשמש. בעת תכנון או בחירת צבעי בסיס, חוקרים נאלצים לעיתים קרובות לבצע עיסקאות חליפין בין האוניברסליות של הגברה הרזולוציה בטקסונומיה השגה מ amplicons שנוצר. מסיבה זו, אלו סוגים של מחקרים בחרה לעיתים קרובות תחל וסמנים המיועדות באופן סלקטיבי הנדונים של microbiome. הערכת ההרכב של קהילות חיידקי מושגת בדרך כלל על ידי רצף אחד או יותר של האזורים hypervariable של^2,3גנים rRNA 16 חיידקי. במחקר זה, אנו מתארים של אמפליקון המבוסס רצף פרוטוקול שפותחו עבור פלטפורמה המיתרים באותו אזור bp V3-V4 מטרות ה-500 של הגן rRNA חיידקי מטוסי אף-16, המאפשר הגברה רחבה של חיידקי taxa גם בעת מתן השתנות מספיקות כדי מבחין בין taxa שונים. בנוסף, פרוטוקול זה בקלות ניתן להתאים לשימוש עם ערכות פריימר אחרות, כגון אלה פילוח הסמן ITS2 של פטריות או יחידת משנה של rRNA 18S של פרוקריוטים.

ואילו השני מתקרב כגון רובה metagenomics, metatranscriptomics ורצף מתא בודד, מציעים יתרונות נוספים לרבות הגנום מיקרוביאלי נפתרה ומדידה ישירה יותר של פונקציית הקהילה, טכניקות אלה הן בדרך כלל יותר יקר ולא שהמפתחות אינטנסיבית יותר פרופיל פילוגנטי המתוארים כאן⁴. בנוסף, ביצוע רובה metagenomics ו- metatranscriptomics על בסיס דגימות התשואות ואחוז גדול של קריאות השייכים הגנום הצמח הפונדקאי, שיטות להתגבר על מגבלה זו מתבצעת עדיין מפותח^5,6.

כמו עם כל פלטפורמה ניסיוני, מבוסס אמפליקון פרופיל יכול להציג את מספר הטיות אפשריות אשר יש לקחת בחשבון במהלך עיצוב ניסיוני וניתוח נתונים. אלה כוללים שיטות איסוף הדגימה DNA החילוץ, מבחר של PCR תחל, איך מתבצעת ההכנה הספרייה. שיטות שונות יכולים להשפיע באופן משמעותי את כמות הנתונים שמיש שנוצר, גם יכול לעכב את המאמצים כדי להשוות בין תוצאות בין מחקרים. לדוגמה, שיטת הסרת חיידקים rhizosphere⁷ והשימוש בטכניקות שונות מיצוי או ברירה של דנ א מיצוי ערכות^8,9 הוכחו להשפיע באופן משמעותי ניתוח במורד הזרם, מה שמוביל מסקנות שונות לגבי אשר חיידקים הם המתנה ו- abundances היחסי שלהם. מאז מבוססי אמפליקון פרופיל יכול להיות מותאם אישית, ביצוע השוואות בין לימודי יכול להיות מאתגר. הפרויקט Microbiome הארץ הציע כי החוקרים ללמוד מערכות מורכבות כגון microbiome צמח-הקשורים ירוויחו הפיתוח של פרוטוקולים סטנדרטיים, כאמצעי מזעור ההשתנות נגרם על-ידי היישום של שיטות שונות בין מחקרים^10,11. כאן, נדון רבים מן הנושאים הנ ל, להציע הצעות לגבי שיטות עבודה מומלצות היכן המתאים.

הפרוטוקול מדגים את התהליך של איסוף קרקע, rhizosphere, ודוגמאות השורש של דורה bicolor ודנ א חילוץ באמצעות ומבוססת DNA בידוד ערכת¹¹. בנוסף, פרוטוקול שלנו כולל אמפליקון מפורט רצף זרימת עבודה, באמצעות פלטפורמה הגדרות שימוש נפוץ, כדי לקבוע את המבנה של קהילות חיידקי^12,13,14. פרוטוקול זה אומתה לשימוש במגוון רחב של צמחים מארחים במחקר שפורסם לאחרונה של שורשים, rhizosphere, הקשורים-קרקעות של 18 מינים monocot, כולל דורה bicolor, זיה מייז, ו חיטת הלחם¹⁵. שיטה זו גם אומתה לשימוש עם גנים אחרים סמן, כפי שמתואר על-ידי היישום המוצלח שלה ללמוד את הגן סמן ITS2 פטרייתי במחקרים של אגבה microbiome^16,17 , תות microbiome ¹⁸.