概要

İndüklenmiş Pluripotent kök hücre kaynaklı tetkikine kullanarak ailesel hiperkolesterolemi insan karaciğer Chimeric fare modeli

Published: September 15, 2018
doi:

概要

Burada, ailesel hiperkolesterolemi insan indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı tetkikine kullanarak bir insan karaciğer chimeric fare modeli oluşturmak için bir protokol mevcut. Bu yeni tedaviler hiperkolesterolemi için test etmek için değerli bir modeldir.

Abstract

Ailesel hiperkolesterolemi (FH) çoğunlukla düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör (LDLR) mutasyonlar neden olur ve kan LDL kolesterol (LDL-C) işaretli yükselmesi nedeniyle erken başlangıçlı kardiyovasküler hastalık riski sonuçları. Statinler, lipid düşürücü ilaçlar FH ve diger hiperkolesterolemi tedavi için ilk satırı olmakla birlikte, yeni yaklaşımlar, şimdi klinik denemeler test edilen belirli PCSK9 antikor olarak ortaya çıkıyor. Yeni tedavi yaklaşımları FH, yeni ilaçlar ya da yeni formülasyonları, keşfetmek için in vivo modelleri uygun. Ancak, farklar insanlara göre lipid metabolik profilleri FH. hayvan mevcut modellerin önemli bir sorun Bu sorunu gidermek için indüklenen FH pluripotent kök hücre (IPSC) kullanarak bir insan karaciğer chimeric fare modeli üretilip-tetkikine (iHeps) türetilmiş. Biz/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) fareler transplante insan hücreleri bağışıklık ret önlemek için ve LDLRetkisini değerlendirmek için kullanılır-eksik iHeps bir LDLR içinde null arka plan. Transplante FH iHeps insan albumini boyama dayalı LRG fare karaciğer % 5-10’u yeniden doldurmanız. Ayrıca, engrafted iHeps lipid düşürücü ilaçlara yanıt ve artan PCSK9 antikorlar statinler için karşılaştırıldığında etkinliğinin klinik gözlemleri recapitulated. İnsan karaciğer chimeric modelimiz böylece FH yeni tedavilere preklinik sınamak için yararlı olabilir. Diğer FH genetik varyantların veya devralınan diğer karaciğer hastalıkları için karşılık gelen mutasyonlar için aynı iletişim kuralını, benzer insan karaciğer chimeric fare kullanılarak da oluşturulabilir.

Introduction

Düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör (LDLR) LDL kolesterol (LDL-C) kan kolesterol sentezi karaciğer modüle yakalar. LDLR gen mutasyonlar ailesel hiperkolesterolemi (FH)1en sık nedenidir. Statinler geleneksel FH ve diğer tip-in (kalıtsal veya edinsel) hiperkolesterolemi tedavi için ilaç ilk satırı olmuştur. Statinler 3-hidroksi-3-methylglutaryl-koenzim kolesterol sentezi karaciğer2düşürmek için bir redüktaz inhibe. Ayrıca, Statinler hepatosit yüzeyindeki plazma LDL-C izni teşvik LDLR düzeylerini artırmak. Ancak, tedavi statinler ile büyük bir ihtar aynı anda proprotein konvertaz subtilisin/hexin 9 (PCSK9), LDLR için onun yıkımı3tanıtmak için bağlar bir enzim ifade ikna etmek olduğunu. Bu etki çok hastalarda gözlenen statinler yetersiz veya bile boş yanıt sorumludur. Bu mekanizma eğitim beklenmedik bir şekilde, hiperkolesterolemi tedavi için alternatif bir yol bulma için yol açmıştır. Yakın zamanda FDA tarafından onaylanmış PCSK9 antikorlar klinik çalışmalarda kullanılmakta olan ve daha yüksek etkinlik ve Statinler4‘ ten daha iyi tolerans göstermek. PCSK9 antikor başarısı Ayrıca hiperkolesterolemi olan hastalarda (PCSK9) yanında LDLR düşmesine yol modüle için diğer tedavi olanakları olabilir anlamına gelir. Benzer şekilde, PCSK9 yeni inhibitörleri antikorlar, örneğin, siRNA oligos5dışında gelişmekte olan ilgi olduğunu.

FH ve hiperkolesterolemi genel olarak başka herhangi bir tür için yeni tedaviler sınamak için uygun vivo içinde modelleri gereklidir. Geçerli vivo içinde büyük bir sorun modelleri, çoğunlukla fare6 ve7, tavşan insanlarla kendi fizyolojik farklılıklar vardır. En önemlisi, bu sorunlar farklı lipid metabolizma profili içerir. İnsan karaciğer chimeric hayvanlar8 nesil bu uyarı üstesinden yardımcı olabilir. İnsan karaciğer chimeric fare insan tetkikine, örneğin, birincil insan tetkikine (pHH)9depolanmışsa, karaciğer ile “insanlaşmış” fare türüdür. Onlar hızlı bir şekilde genişletilmiş ex vivo, olamaz pHH ile ilgili bir sorun olduğunu işlevlerine yalıtım üzerine kaybetmek ve sınırlı bir kaynaktır. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) kullanımı pHH bir alternatiftir-tetkikine (iHeps)10türetilmiş. Özellikle iPSCs hastaya özgü olduğunu ve iHeps taze pHH önemli bir avantaj olan isteğe bağlı olarak üretilen bu yüzden sonsuza kadar yetiştirilir. Ayrıca, iPSCs da kolayca düzeltin veya daha sadık karşılaştırmalar11izin vermek için isogenic bir arka plan mutasyonların tanıtmak için tasarımcı enzimler ile genetik olarak.

İnsan karaciğer chimeric fare ile engrafted pHH insanlarda karaciğer metabolik profilleri, uyuşturucu yanıt ve hepatit virüsü enfeksiyonu12duyarlılık için benzerlikler gösterir. Bu hiperlipidemi vivo içindeçalışmak için iyi bir model sağlar. En çok kullanılan fare modelleri/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (FRG) fare13 ve uPA transgenik fare8içinde hangi ilâ %95 fare karaciğer pHH tarafından değiştirilebilir, temel alır. İlginçtir, bir rapora (FRG fare bağlı olarak) bir insan FH karaciğer chimeric fare ile pHH bir homozigoz LDLR mutasyon14taşıyan bir hastadan nitelendirdi. Bu modelde, repopulated insan tetkikine hiçbir işlev LDLR vardı ama artık fare tetkikine yaptım, böylece azaltmak belgili tanımlık yarar- in vivo LDLR yolu üzerinde güvenerek ilaçların test gerçekleştirmek için.

Burada, detaylı bir protokol FH iHeps Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) fare karaciğer engrafting için bizim kısa bir süre önce iş15 temel raporu. Bu insan karaciğer chimeric fare FH modelleme ve uyuşturucu testi gerçekleştirmek için yararlıdır içinde vivo.

Protocol

Hayvanlar kullanımı dahil tüm yöntem tanımlamak burada kullanmak, canlı hayvanlar öğretim ve araştırma (CULATR) Hong Kong Üniversitesi Komitesi tarafından onaylanmış olması. 1. hazırlık ve fenotipik test fare İmmünyetmezligi Ldlr nakavt (KO) fareler nesil. Fareler suşları Ldlr- / -, Rag2- / -ve Il2rg- / – ( Tablo malzemelerigörmek) kullanın. …

Representative Results

Yönlendirilmiş farklılaşma insan iPSCs iHeps içine% 70 izdiham ulaşmak zaman, iHeps bir 3-adım Protokolü16 (Şekil 1 üst paneli) ile içine insan iPSCs farklı. Endoderm farklılaşma 3 gün sonra IPSC kolonileri gevşetti ve tam izdiham (Şekil 1 alt paneli) yayıldı. Sonra 2nd sahne orta, hepatoblasts görünür ve çoğalırlar. Bu hücreler kalabalık ama açı…

Discussion

Önceki çalışmalarda iHeps kemirgen kullanarak onlar devralınan karaciğer hastalıkları17eğitim için etkili bir yoldur doğruladı. Bu teknolojinin kullanımı daha da genişletmek ve geçerli FH hayvan modelleri suboptimal olduğu için biz LRG fareler FH iHeps engrafted ve engrafted LDLR +/-veya Heterozigoz LDLRgösterdi-mutasyona uğramış FH iHeps fareler plazma LDL-C düzeyini azaltabilir ve vivo içindeyanıt lipid düşürücü ilaçlar.

<p class="jov…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Shenzhen bilim ve teknoloji Konseyi temel araştırma programı (JCYJ20150331142757383), Çin Academy of Sciences (XDA16030502), Hong Kong araştırma hibe Konseyi Tema araştırma dayalı stratejik öncelik araştırma programı tarafından desteklenmiştir Düzeni (T12-705/11), Hong Kong özel idari bölge araştırma hibe Kurumu ve Çin (N-HKU730/12 ve 81261160506), araştırma takım projesinin Guangdong doğal bilim Ulusal Doğal Bilim Vakfı işbirliği programı Vakfı (2014A030312001), Guangzhou bilim ve teknoloji programı (201607010086) ve Guangdong Eyaleti bilim ve teknoloji programı (2016B030229007 ve 2017B050506007).

Materials

Materials
40 µm Cell strainer BD B4-VW-352340
6-Well plate Thermofisher 140675 Extracellular matrix coated
Accutase Millipore SCR005
Acetylcholine Sigma Aldrich A6625 Dissolve in water
Antigen retrieval solution IHC World IW-1100-1L
Calcium chloride Sigma Aldrich C8106 CaCl2
Cell dissociation enzyme Thermofisher 12604-013 TrypLE
D-glucose Sigma Aldrich D8270
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D5879 DMSO
DMEM Thermofisher 10829 Knockout DMEM
DNase I Roche 11284932001
EDTA USB 15694 0.5 M, PH=8.0
Extracellular matrix (for cell suspension) Corning 354234 Matrigel
Extracellular matrix (for iHep differentiation) Corning 354230 Matrigel
Hepatocyte basal medium Lonza CC-3199
Hepatocyte culture medium Lonza CC-3198
High-fat and high-cholesterol diet Research Diet D12079B
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human hepatocyte growth factor Peprotech 100-39
Human iPSC maintenance medium STEMCELL Technologies 5850 mTeSR1
Human oncostatin M Peprotech 300-10
Ketamine 10% Alfasan N/A
L-glutamine Thermofisher 35050
LDL-C detection kit WAKO 993-00404 and 993-00504
Magnesium chloride VWR P25108 MgCl2
Meloxicam Boehringer Ingelheim NADA 141-213
Monopotassium phosphate USB S20227 KH2PO4
Non-essential amino acids Thermofisher 11140
PBS GE SH30256.02 Calcium and magnesium-free
PCSK9 antibodies Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals SAR236553/REGN727 Alirocumab
Phenobarbital Alfamedic company 013003
Phenylephrine RBI P-133 Dissolve in water
Potassium chloride Sigma Aldrich P9333 KCl
Povidone-iodine Mundipharma Betadine
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
ROCK inhibitor Y27632 Sigma Aldrich Y0503-5MG
RPMI 1640 Thermofisher 21875
Serum replacement Thermofisher 10828
Silicone coated petri dish Dow Corning Sylgard 184 silicone elastomer kit
Simvastatin Merck Sharp & Dohme ZOCOR
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6297 NaHCO3
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653 NaCl
Trypan blue solution 0.4% Thermofisher 15250061
U-46619 Cayman 16450 Dissolve in DMSO
Xylazine 2% Alfasan N/A
β-mercaptoethanol Thermofisher 31350
Name Company Catalog Number コメント
Antibodies
AAT DAKO A0012 1:400
ALB Bethyl Laboratories A80-129 1:200
ASGPR Santa Cruz Sc-28977 1:100
HNF4A Santa Cruz Sc-6557 1:35
NANOG Stemgent 09-0020 1:200
OCT4 Stemgent 09-0023 1:200
Name Company Catalog Number コメント
Mice
Il2rg-/- Jacson lab 003174
Ldlr-/- Jacson lab 002077
Rag2-/- Jacson lab 008449
Name Company Catalog Number コメント
Equipments
Automated cell counter Invitrogen Countess
Gamma irradiator MDS Nordion Gammacell 3000 Elan II
Insulin syringe BD 324911
Powerlab ADInstruments Model 8/30
Slides scanning system Leica biosystems Aperio scanScope system
Sliding Microtome Leica biosystems RM2125RT
Stereomicrocope Nikon SMZ800
Tissue processing system Leica biosystems ASP200S
Wire myograph DMT 610M
Name Company Catalog Number コメント
Softwares
Digital slide viewing software Leica Aperio ImageScope Version 12.3.2
Image J NIH Version 1.51e
Image processing software Adobe Photoshop CC Version 2015
Microscope imaging software Carl Zeiss AxioVision LE Version 4.7

参考文献

  1. Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
  2. Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
  3. Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
  4. Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
  5. Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
  6. Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
  7. Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
  8. Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
  9. Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
  10. Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
  11. Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
  12. Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
  13. Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
  14. Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
  15. Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
  16. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  17. Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
  18. Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
  19. Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).

Play Video

記事を引用
Yang, J., Wong, L., Tian, X., Wei, R., Lai, W., Au, K., Luo, Z., Ward, C., Ho, W., Ibañez, D. P., Liu, H., Bao, X., Qin, B., Huang, Y., Esteban, M. A., Tse, H. A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes. J. Vis. Exp. (139), e57556, doi:10.3791/57556 (2018).

View Video