Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish
概要
Qui, presentiamo un protocollo per l’ablazione di una sottopopolazione geneticamente con etichetta dei neuroni da un laser del due-fotone da larve di Zebrafish.
Abstract
Per identificare il ruolo di una sottopopolazione di neuroni nel comportamento, è essenziale per verificare le conseguenze di bloccare la sua attività in animali vivi. L’ablazione laser dei neuroni è un metodo efficace per questo scopo quando i neuroni sono etichettati in modo selettivo con sonde fluorescenti. Nello studio presente, vengono descritti i protocolli per il laser, l’ablazione di una sottopopolazione di neuroni utilizzando un microscopio a due fotoni e test delle sue conseguenze funzionali e comportamentali. In questo studio, comportamento di cattura di prede nelle larve di zebrafish è utilizzato come un modello di studio. Il circuito pretecto-ipotalamico è conosciuto per essere alla base di questa preda visivamente-driven cattura il comportamento. Zebrafish pretetto erano ablazione laser, e l’attività neuronale nel lobo inferiore dell’ipotalamo (ILH; la destinazione della proiezione pretectal) è stato esaminato. Comportamento di cattura di prede dopo ablazione pretectal inoltre è stato provato.
Introduction
Per capire come comportamento nasce dall’attività neuronale nel cervello, è necessario identificare i circuiti neurali che sono coinvolti nella generazione di quel comportamento. Allo stadio larvale, zebrafish fornisce un modello animale ideale per studiare la funzione del cervello connesso con il comportamento, perché i loro cervelli piccoli, trasparenti consentono di indagare l’attività di un neurone ad una risoluzione cellulare in una vasta zona della cervello osservando il comportamento1. La formazione immagine dell’attività neuronale in neuroni specifici è diventato possibile attraverso l’invenzione di indicatori codificato geneticamente calcio (Ca) (GECIs) come GCaMP2. Zebrafish transgenici GCaMP hanno dimostrato di essere utile per l’associazione funzionale circuito neurale con comportamento conducendo imaging Ca a comportarsi animali3.
Mentre la formazione immagine Ca può dimostrare correlazioni tra attività neuronale e comportamento, per mostrare la causalità, soppressione dell’attività neuronale e prova la sua consequence(s) il comportamento sono passi importanti. Ci sono vari modi per raggiungere questo obiettivo: utilizzare di mutazione genetica che altera i circuiti neurali specifici4, espressione delle neurotossine in neuroni specifici5,6, uso di strumenti di optogenetica come halorhodopsin7, e ablazione di neuroni mirate8,9laser. L’ablazione laser è particolarmente adatta per l’eliminazione di attività in un numero relativamente piccolo di neuroni specifici. Eliminazione irreversibile dell’attività neuronale uccidendo i neuroni facilita la valutazione comportamentale conseguenze.
Un comportamento interessante che può essere osservato nella fase larvale in zebrafish è la cattura di prede (Figura 1A). Questo comportamento visivamente guidato, obiettivo-diretto fornisce un favorevole sistema sperimentale per lo studio della acuità visiva10, trasformazione visuomotoria11,12,13, percezione visiva e riconoscimento della oggetti14,15,16,17,18e il processo decisionale19. Come preda è riconosciuto dai predatori e come preda rilevamento conduce alla preda cattura comportamento è stato una questione centrale in neuroethology20. In questa carta, ci concentriamo sul ruolo del circuito pretecto-ipotalamica formato da proiezioni di un nucleo nel pretetto (nucleo pretectalis superficialis pars magnicellulare, d’ora in avanti, semplicemente notato come il pretetto) per il ILH. Ablazione laser del Pretetto è stato indicato per ridurre l’attività di cattura di prede e abolire l’attività neuronale in ILH che è associato con la percezione visiva preda21. Qui, protocolli per l’esecuzione di laser ablazione e prova il suo effetto utilizzando Ca2 + imaging e registrazione del comportamento in zebrafish larve sono descritti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se il laser del due-fotone ha un’ottima risoluzione spaziale per specificamente l’ablazione singoli neuroni, deve essere grande cautela per evitare danni indesiderati sul tessuto cerebrale a causa del calore. Il passo più importante nell’esperimento ablazione consiste nel determinare la quantità ottimale di irradiazione del laser. Irraggiamento insufficiente riesce a uccidere i neuroni. Troppa irradiazione sarà danno termico al tessuto circostante, che si tradurrà in effetti indesiderati. La gamma ottimale di i…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questi studi sono stati finanziati da contributi ricevuti dal MEXT, JSPS KAKENHI Grant numeri JP25290009, JP25650120, JP17K07494 e JP17H05984.
Materials
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
参考文献
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