Ablation d’une Population neuronale à l’aide d’un Laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre
概要
Nous présentons ici un protocole pour l’ablation d’une sous-population génétiquement marquée de neurones par un laser à deux photons de larves de poisson zèbre.
Abstract
Pour identifier le rôle d’une sous-population de neurones dans le comportement, il est essentiel de tester les conséquences du blocage de son activité dans les animaux vivants. Ablation par laser de neurones est une méthode efficace à cet effet lorsque les neurones sont sélectivement marquées avec des sondes fluorescentes. Dans la présente étude, les protocoles pour laser ablation une sous-population de neurones à l’aide d’un microscope biphotonique et l’essai de ses conséquences fonctionnelles et comportementales sont décrits. Dans cette étude, le comportement de capture des proies chez les larves de poisson zèbre est utilisé comme un modèle d’étude. Le circuit pretecto-hypothalamique est connu pour sous-tendre cette proie pilotée par visuellement capture le comportement. Poisson zèbre prétectum étaient ablation au laser, et l’activité neuronale dans le lobe inférieur de l’hypothalamus (ILH ; la cible de la projection pretectal) a été examinée. Comportement de capture des proies après ablation pretectal a également été testé.
Introduction
Pour comprendre comment le comportement résulte de l’activité neuronale dans le cerveau, il est nécessaire d’identifier les circuits neurones qui sont impliqués dans la génération de ce comportement. Au stade larvaire, le poisson-zèbre fournit un modèle animal idéal pour étudier le fonctionnement du cerveau associées le comportement parce que leur cerveau petit, transparent permettre d’enquêter sur l’activité neuronale à une résolution cellulaire dans un vaste domaine de la cerveau tout en observant le comportement1. Imagerie de l’activité neuronale dans les neurones spécifiques est devenue possible grâce à l’invention des indicateurs génétiquement encodé calcium (Ca) (GECIs) comme GCaMP2. GCaMP zebrafish transgénique ont révélé utile permettant d’associer le circuit neuronal fonctionnel avec un comportement en procédant à l’imagerie Ca en se comportant des animaux3.
Alors que l’imagerie Ca peut démontrer les corrélations entre l’activité neuronale et comportement, pour montrer le lien de causalité, suppression de l’activité neuronale et les essais de ses conséquences sur le comportement sont des étapes importantes. Il existe différentes façons d’y parvenir : l’utilisation de la mutation génétique qui altère les circuits neuronaux spécifiques4, expression des neurotoxines de neurones spécifiques5,6, utilisation d’outils d’optogenetic comme halorhodopsin7, et laser ablation de neurones ciblés8,9. Ablation laser est particulièrement adaptée pour l’élimination de l’activité dans un relativement petit nombre de neurones spécifiques. Facilite l’élimination irréversible de l’activité neuronale en tuant les neurones évaluant les conséquences comportementales.
Un comportement intéressant que l’on peut observer au stade larvaire chez le poisson zèbre est la capture des proies (Figure 1A). Ce comportement guidé visuellement, ciblé fournit un système expérimental favorable pour l’étude de l’acuité visuelle10, visuomotor transformation11,12,13, perception visuelle et la reconnaissance des objets14,15,16,17,18et19de la prise de décision. Comment proies est reconnu par les prédateurs et comment la détection des proies mène à proie capture le comportement a été une question centrale dans la neuroéthologie20. Dans cet article, nous nous concentrons sur le rôle du circuit pretecto-hypothalamique formé par les saillies d’un noyau dans le prétectum (noyau pretectalis superficialis pars magnocellularis, ci-après, simplement remarqué que le prétectum) à la ILH. Ablation au laser de la prétectum a été montré pour réduire l’activité de capture des proies et d’abolir l’activité neuronale dans la ILH associé à la proie visual perception21. Ici, des protocoles pour l’exécution de laser ablation et tester son effet à l’aide de Ca2 + imagerie et enregistrement comportemental chez le poisson zèbre, les larves sont décrites.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que le deux photons laser a une excellente résolution spatiale pour spécifiquement l’ablation des neurones individuels, grande prudence convient pour éviter tout dommage non désiré sur le tissu cérébral en raison de la chaleur. L’étape la plus importante dans l’expérience d’ablation est de déterminer la quantité optimale d’irradiation laser. Irradiation insuffisante ne parvient pas à tuer les neurones. Trop d’irradiation sera endommagé par la chaleur le tissu environnant, ce qui donnera lieu…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces études ont été financées par des subventions provenance du MEXT, JSPS KAKENHI Grant numéros JP25290009, JP25650120, JP17K07494 et JP17H05984.
Materials
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
参考文献
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