概要

הערכת ההשפעה של חלבון צבירה על סטרס חמצוני הסלולר ב שמרים

Published: June 23, 2018
doi:

概要

חלבון צבירת מעורר הסלולר סטרס חמצוני. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור את המדינות amyloidogenic חלבונים תאיים סטרס חמצוני המשויכים אליהן, באמצעות cytometry זרימה. הגישה משמש כדי ללמוד על אופן הפעולה של גרסאות מסיסים ונוטה צבירת של פפטיד עמילואיד-β.

Abstract

חלבון misfolding, צבירת לתוך עמילואיד הייצורים החיים קשורה עם התחלתה של התקדמות של מספר מחלות ניווניות. עם זאת, יש עדיין מעט מידע על חלבונים מסיסים איך אגרגטים להפעיל את ההשפעות הרעילות שלהם בתוך vivo. אורגניזמים פשוטים prokaryotic ו האיקריוטים מודל, כגון חיידקים, שמרים, תרמו משמעותית להבנתנו הנוכחי של המנגנונים מאחורי היווצרות עמילואיד תאיים, הפצת אגרגטים, רעילות. ב פרוטוקול זה, השימוש של שמרים מתואר כמודל לנתח את הקשר בין היווצרות של אגרגטים חלבון והשפעתם על הסלולר סטרס חמצוני. השיטה משלבת את הגילוי של המדינה מסיסים/המצטברים תאיים החלבון amyloidogenic עם כימות של נזק חמצוני הנובע ביטויה באמצעות cytometry זרימה (FC). גישה זו היא פשוטה, מהירה, כמותית. המחקר מדגים את הטכניקה על-ידי התאמת את הסלולר עקה הנגרמת על ידי קבוצה גדולה של עמילואיד-β משתנים פפטיד עם שלהם מספק שלעצמו צבירת מהותי בהתאמה.

Introduction

פרוטוסטאזיס הוא דטרמיננטה הבסיסית של כושר תא ותהליכי הזדקנות. תאים, חלבון הומאוסטזיס נשמר על ידי בקרת איכות החלבון המתוחכם רשתות שנועד להבטיח את נכונות refolding של חלבונים misfolded conformers מלווים ו/או proteolysis יישוב שלהם עם מספר מנגנונים שנשמרת היטב1 ,2,3,4,5. מספר רב של מחקרים מספקים תמיכה לקשר בין התפתחות והתקדמות של מגוון רחב של מחלות האדם וכישלון פרוטוסטאזיס, המוביל אל חלבון misfolding, צבירת. למשל, הנוכחות של חלבון פיקדונות נחשב סימן היכר פתולוגי של הפרעות ניווניות רבים, כמו אלצהיימר, פרקינסון, ו הנטינגטון מחלות6,7,8, מחלות prionogenic, amyloidoses ניוונית9. הוצע כי הרכבות oligomeric, protofibrillar מוקדמת בהתגובה צבירת הן elicitors הראשי של cytotoxicity, הקמת aberrant אינטראקציות עם חלבונים אחרים חצרו הסלולר צפוף10. בנוסף, חלבון הכללות (PI) יכול להיות מועבר בין תאים, הפצת שלהם השפעה רעילה11,12. לכן, זה יכול להיות כי היווצרות של PI אולי אכן מהווה מנגנון בעלת מגבילה את נוכחותם של מינים צבורים מסוכן למיקומים ספציפיים בתא, היכן ניתן לעבד או שנצבר ללא תופעות לוואי משמעותיות 13 , 14.

תקן במבחנה גישות הביוכימי סיפקו תובנות חשובות מינים שונים that לאכלס את צבירת תגובות ו15,שלהם מאפיינים16. עם זאת, תנאי שימוש אלה מבחני בבירור שונות מאלו המתרחשים בתוך התא ולתשאל, לכן, מאבדים רלבנטיות פיזיולוגיים. בגלל השימור הבולטים של מסלולים סלולריים כגון בקרת איכות חלבון, autophagy או ברגולציה של הסלולר חמצון-חיזור המדינה17,18 בין פרוקריוטים19,20,21 ,22,23, שמרים ניצני האפייה (cerevisiae ס) התפתחה מיוחס מודל הסלולר פשוט ללמוד על גורמים מולקולרית של צבירת חלבון והשפעתו המשויך ציטוטוקסיות סביבות ביולוגית רלוונטית24,25,26.

חלבון צבירת הנטייה היא תכונה מטבעו מקודד ברצף העיקרי. לפיכך, היווצרות עמילואיד-מבני ניתן לחזות המבוסס על זיהוי, הערכה של עוצמת קידום צבירת אזורים polypeptides27. עם זאת, למרות ההצלחה של אלגוריתמים bioinformatic כדי לחזות את המאפיינים צבירת במבחנה של רצפי חלבונים, הם עדיין רחוק מלהיות חיזוי איך לתרגם אלה מספק שלעצמו ויוו ציטוטוקסיות ההשפעה. מחקרים כתובת הקישור בין המדינה צבורים של חלבון נתון שלה נזק תאי המשויכים בצורה שיטתית עשוי לעזור כדי לעקוף מגבלה זו חישובית. חיבור זה הוא התייחס במחקר הנוכחי, ניצול של סט גדול של גרסאות של פפטיד עמילואיד-β Aβ42 שונות רק ב משקע יחיד, אך הצגת טווח רציף של צבירת מספק שלעצמו ויוו28. בפרט, מתואר גישה מבוססת-FC לזהות את הזן הסתגלותי החשבונאי נזק חמצוני שהפיק צבירת נוטה חלבונים בתאים שמרים. המתודולוגיה מספק יתרונות רבים כגון פשטות, תפוקה גבוהה יכולת מדידה כמותית מדויקת. גישה זו אפשרו לאשר את PI לשחק תפקיד מגן מפני עקה.

Protocol

1. תרבויות cerevisiae ס וביטוי חלבונים הערה: גרסאות Aβ התערוכה מספק שלעצמו צבירת היחסי שונה עקב מוטציה בגן משקע אחד במיקום 19 (Phe19) של פפטיד Aβ42 (איור 1 א’). גרסאות פפטיד אלה מתויגות עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), אשר משמש כתב (איור 1) צבירת29</…

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעסיק אוסף של משתנים 20 של פפטיד Aβ42 שבו יש כבר מוטציה Phe19 proteinogenic טבעי כל חומצות אמינו28. מספק צבירת התיאורטי שלעצמו החלבונים האלה ניתן לנתח באמצעות אלגוריתמים שונים bioinformatic שני (AGGRESCAN וטנגו31,32). בשני המקרים…

Discussion

מגוון רחב של מחלות קשורה להצטברות של חלבונים misfolded לתוך הסלולר פיקדונות6,7,8,33. מאמצים רבים נעשו כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים המפעילות את התפרצות של מחלות אלו באמצעות גישות חישובית, אשר לא עשה חשבון חלבון ריכוזים, א…

Acknowledgements

   

Materials

Yeast cells BY4741  ATCC 201388 Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
pESC(-Ura) plasmid  Agilent Genomics 217454 Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements Sigma Y1501 Powder
Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids Sigma Y0626 Powder
Raffinose Sigma R7630 Powder
Glucose Sigma G7021 Powder
Galactose Sigma G0750 Powder
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3991  Solution 10X
CellROX Deep Red Reagent  Life Technologies C10422 Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. 
Y-PER protein extraction reagent  Thermo Scientific 78990 Liquid cell lysis buffer
Acrylamide/Bis-acrylamide Sigma A6050 Solution
Bradford dye reagent Bio-Rad  5000205 Dye reagent for one-step determination of protein concentration
β-amyloid antibody 6E10  BioLegend 803001 Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).
Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate  Bio-Rad 1721011
Membrane Immobilon-P, PVDF Millipore IPVH00010
Luminata forte Merk WBLUF0100 Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) Sigma 93482 Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol
FACSCanto flow cytometer  BD Biosciences 657338 Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter
Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell Bio-Rad 1703930 Protein transference system
Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems Bio-Rad 1658000FC Electrophoresis system

参考文献

  1. Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).
  2. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  3. Wong, E., et al. Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy. Nature Communications. 3, (2012).
  4. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).
  5. Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).
  6. Dobson, C. M. Getting out of shape. Nature. 418, 729-730 (2002).
  7. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  8. Aguzzi, A., O’Connor, T. Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives. Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).
  9. Rapezzi, C., et al. Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview. Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).
  10. Deas, E., et al. Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson’s disease. Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).
  11. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).
  12. Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).
  13. Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431, 805-810 (2004).
  14. Ross, C. A., Poirier, M. A. Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).
  15. Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red. Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).
  16. Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay. Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).
  17. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker’s yeast?. Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).
  18. Tenreiro, S., Outeiro, T. F. Simple is good: yeast models of neurodegeneration. FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).
  19. Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 47, 9-16 (2015).
  20. Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).
  21. Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex. eLife. 5, (2016).
  22. Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).
  23. Figley, M. D., Gitler, A. D. Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS. Rare Diseases. 1, e24420 (2013).
  24. Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
  25. Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).
  26. Bharathi, V., et al. Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33, 607-620 (2016).
  27. Pallarès, I., Ventura, S. Advances in the prediction of protein aggregation propensity. Current Medicinal Chemistry. , (2017).
  28. Villar-Piqué, A., Ventura, S. Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).
  29. Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria. Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).
  30. Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. Linking amyloid protein aggregation and yeast survival. Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).
  31. Conchillo-Solé, O., et al. AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of "hot spots" of aggregation in polypeptides. BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).
  32. Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins. Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).
  33. Renner, M., Melki, R. Protein aggregation and prionopathies. Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).
  34. Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress. Redox Biology. 12, 699-711 (2017).

Play Video

記事を引用
Carija, A., Ventura, S., Navarro, S. Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast. J. Vis. Exp. (136), e57470, doi:10.3791/57470 (2018).

View Video