Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad
概要
Aquí, presentamos un protocolo para determinar la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón crudo usando MALDI-TOF espectrometría de extractos.
Abstract
Las proteasas tienen varias funciones biológicas, incluyendo digestión de comida y la activación/inactivación de proteínas. Identificar la especificidad de la proteasa es importante para revelar la función de la proteasa. El método propuesto en este estudio determina la especificidad de la proteasa midiendo el peso molecular de sustratos únicos mediante desorción/ionización del Laser asistida por matriz de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Los sustratos contienen iminobiotin, mientras que el sitio hendido consiste en aminoácidos, y consiste en el separador de glicol de polietileno. El sustrato exfoliado generará un único peso molecular utilizando un aminoácido exfoliado. Uno de los méritos de este método es que se puede llevar a cabo en una maceta utilizando muestras de crudo, y también es adecuado para evaluar las muestras múltiples. En este artículo, describimos un método experimental sencillo optimizado con muestras extraídas de tejido de pulmón de ratón, incluyendo extracción de tejido, colocación de sustratos digestivos en muestras, depuración de digestivos sustratos bajo condiciones de pH diferentes y la medición del peso molecular de los sustratos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. En Resumen, esta técnica permite la identificación de la especificidad de la proteasa en muestras de crudo derivados de extractos de tejidos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, que puede fácilmente ampliarse para el procesamiento de las muestras múltiples.
Introduction
Proteasas regulan procesos fisiológicos por unirse a las proteínas, y el inicio de la actividad de la proteasa en momentos concretos y lugares es regulada1. Por lo tanto es importante identificar la expresión y actividad de los tejidos que están reguladas localmente y para desarrollar un nuevo método para detectar las proteasas. El método propuesto en este estudio tiene como objetivo identificar la especificidad de la proteasa en paralelo a la detección de las proteasas.
Existen algunos métodos para detectar la especificidad de la proteasa. El método de azocasein es bien sabido para su uso en la detección de las proteasas2 pero está limitado en su capacidad para obtener más información. Zymography es otro método de detección integral de proteasa que puede utilizarse para determinar el peso molecular de proteasas3, pero no puede utilizarse para examinar la especificidad de sustrato. Especificidad de la proteasa puede determinarse por análisis espectrométricos, utilizando sustratos como la p-nitroanilida4y los análisis fluorométrico, usando cumarina sustratos5 o de ensayos de transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET)6. Estos métodos permiten detección única especificidad de sustratos contenidos en un solo pozo. En el presente estudio, la especificidad de la proteasa de extractos de tejido se examina bajo diversas condiciones, ya que estos extractos contienen proteasas múltiples. Actividad de las proteasas es regulada por varios factores, incluyendo fuerza del ion, pH, coenzimas y grupos prostéticos. Recientemente, se han utilizado métodos basados en proteómica para identificar la especificidad de la proteasa; por ejemplo, el método reportado por Biniossek et al. 7 el proteoma se utiliza para determinar la especificidad de sustrato incluso en extractos crudos y permite la determinación exacta de la actividad de la hendidura de las proteasas que reconocen múltiples secuencias de aminoácidos8. Sin embargo, este método no es adecuado para el análisis de numerosas muestras. En cambio, nuestro método permite el procesamiento simultáneo de múltiples muestras y el uso de mediante desorción/ionización del Laser (MALDI-TOF) de tiempo de vuelo espectrometría de masas para el análisis de la muestra facilita la detección rápida y fácil de la hendida sustratos.
Este documento describe un método para evaluar la especificidad de la proteasa utilizando espectrometría de masas MALDI-TOF para medir el peso molecular de sustratos únicos. Las formas moleculares de sustratos troceados, junto con su peso molecular teórico, se muestran en la figura 1 y tabla 1. Estudios previos han utilizado substratos que contienen separadores de polyglycine y biotina9; sin embargo, estos sustratos son defectuosas porque la secuencia de polyglycine puede ser troceada por enzimas que reconocen la secuencia de la glicina. Además, la alta afinidad entre la avidina y la biotina puede conducir a una tasa de recuperación bajo. Para mejorar estos inconvenientes, en este estudio que sintetizaron un sustrato único, que fue compuesto de polietilenglicol (PEG), iminobiotin y un aminoácido que puede identificar el sitio de la hendidura (figura 1). Para discriminar entre aminoácidos de peso molecular similar, D-serina fue agregado entre el espaciador PEG y el aminoácido en el sitio exfoliado.
El N-terminal del sustrato fue etiquetado con iminobiotin, que permite la purificación de la afinidad de muestras de crudo. El uso de iminobiotin en lugar de biotina es crítico; la biotina tiene una fuerte afinidad con la avidina, que se traduce en las tasas de baja recuperación de sustratos marcados con biotina de la resina de la avidina, mientras que la afinidad de iminobiotin de avidina puede ser alterado por pH. Sustratos marcados Iminobiotin se unirán a avidina en condiciones por encima de pH 9, mientras que la avidina libera sustratos marcados con iminobiotin en condiciones por debajo de pH 4. Por lo tanto, iminobiotin fue utilizado para la purificación de afinidad10. En Resumen, se describe un protocolo detallado para detectar la especificidad de proteasa utilizando sustratos únicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo utiliza la espectrometría de masas MALDI-TOF para identificar la especificidad de la proteasa en muestras de crudo derivados de extractos de tejido y puede fácilmente ampliarse para el procesamiento de las muestras múltiples. En particular, manipulamos pH para causar un cambio en la especificidad de sustrato.
Se utilizó el método de (ABC) complejo avidina-biotina, que ha sido ampliamente utilizado en Bioquímica debido a su especificidad de Unión, en nuestro protocolo. Deb…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por la beca de investigación Universidad Farmacéutica Nihon Nihon Pharmaceutical University (2016) y el MEXT KAKENHI concesión número JP17854179.
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
参考文献
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
