Определение специфики протеазы в ткани мыши извлекает, масс-спектрометрия MALDI-TOF: манипулирования PH вызвать специфики изменения

Протеаз регулировать физиологические процессы раскалыванием белков, и начало деятельности протеазы в определенное время и местах регулируется¹. Поэтому важно определить выражение и активность тканей, которые регулируются на местном уровне и разработать новый метод для обнаружения протеаз. Предлагаемый метод в это исследование направлено на выявление специфики протеазы параллельно для обнаружения протеаз.

Есть несколько методов для обнаружения протеазы специфичности. Метод azocasein well-known для его использования в обнаружении протеаз² , но ограничены в своей способности для получения дополнительной информации. Зимография является еще одним методом обнаружения всеобъемлющей протеазы, который может использоваться для определения молекулярная масса протеаз³, но он не может использоваться для изучения субстратная специфичность. Специфика протеазы может определяться спектрометрический анализы, используя субстратов, например⁴p-nitroanilide и флуориметрический анализов, используя кумарин субстратах⁵ или анализов флуоресценции передачи энергии резонанса (ЛАДА)⁶. Эти методы позволяют сингл специфичность обнаружения субстратов, содержащихся в одной скважине. В настоящем исследовании специфика протеазы ткани экстрактов рассматривается в различных условиях, как эти экстракты содержат несколько протеаз. Протеазы деятельность регулируется рядом факторов, включая рН, коферменты, протезно групп и ионная сила. Недавно на основе протеомики методы были использованы для выявления специфики протеазы; например метод сообщает Biniossek и др. ⁷ использует протеома для определения субстратная специфичность даже в сырой экстрактов и позволяет точное определение расщепления активности протеаз, которые признают несколько аминокислотных последовательностей⁸. Однако этот метод не подходит для анализа многочисленных образцов. В противоположность этому, наш метод позволяет одновременной обработки нескольких образцов, а также использование Matrix-Assisted лазерной десорбции/ионизации время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии для анализа проб облегчает быстрое и простое обнаружение рассеченного субстраты.

Этот документ описывает метод для оценки специфика протеаз с помощью масс-спектрометрия MALDI-TOF для измерения молекулярной массой уникальных субстратов. Молекулярные формы рассеченного субстратов, а также их теоретической молекулярным весом, показаны на рисунке 1 и в таблице 1. Предыдущие исследования использовали субстраты, содержащие polyglycine прокладки и биотин⁹; Однако эти субстраты ошибочны, потому что polyglycine последовательности может быть расщепляется ферментами, которые признают глицин последовательности. Кроме того высокое сродство между авидином и биотина может привести к низкой восстановления курса. Чтобы улучшить эти недостатки, в этом исследовании мы синтезированных уникальный субстрат, который состоит из полиэтиленгликоля (PEG), иминобиотин и аминокислоты, которые могли бы идентифицировать расщепления сайта (рис. 1). Чтобы различать аминокислоты подобными молекулярными весами проникли, D-Серина был добавлен между PEG распорку и аминокислот на объекте рассеченного.

N-терминальный субстрата было названо с иминобиотин, который позволяет очищение сродства от сырой образцов. Использование иминобиотин вместо биотин является критически важным; биотин имеет сильное сродство с авидин, что приводит к низкой восстановления ставок биотин меченых субстратов из авидин смолы, в то время как иминобиотин в сродство для авидин может быть изменено, рН. Иминобиотин меченых субстратов будет привязан к авидин в условиях выше pH 9, в то время как авидин выпускает иминобиотин меченых субстратов в условиях ниже рН 4. Таким образом иминобиотин был использован для очищения сродства¹⁰. В целом мы описываем подробный протокол для выявления специфики протеазы, с использованием уникальных субстратов.