概要

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Published: May 25, 2018
doi:

概要

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a especificidade da protease no tecido cru rato extratos usando espectrometria de MALDI-TOF.

Abstract

Proteases têm várias funções biológicas, incluindo a digestão de alimentos e ativação/inativação de proteínas. Identificar a especificidade da protease é importante por revelar a função de protease. O método proposto neste estudo determina a especificidade de protease medindo-se o peso molecular de substratos exclusivos usando Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF). Os substratos contêm iminobiotin, enquanto o site clivado consiste de aminoácidos, e o espaçador é composto por polietileno glicol. O substrato clivado irá gerar um único peso molecular, usando um ácido aminado clivado. Um dos méritos desse método é que pode ser efectuada em uma panela, usando amostras brutas, e é também adequado para avaliar várias amostras. Neste artigo, descrevemos um método experimental simples otimizado com amostras extraídas do tecido do pulmão do rato, incluindo a extracção de tecido, colocação de substratos digestivos em amostras, purificação de substratos digestivos sob condições de pH diferente e medição de peso molecular dos substratos, utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF. Em resumo, esta técnica permite a identificação da especificidade da protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido usando espectrometria de massa MALDI-TOF, que facilmente pode ser ampliada para múltiplo processamento de amostra.

Introduction

Proteases regulam processos fisiológicos por clivagem de proteínas, e o início da atividade de protease em horários específicos e locais é regulamentado1. Portanto, é importante identificar a expressão e a atividade dos tecidos que são regulamentados localmente e desenvolver um novo método para detectar proteases. O método proposto neste estudo visa identificar a especificidade da protease em paralelo para detecção de proteases.

Existem alguns métodos para a detecção de especificidade de protease. O método azocasein é conhecido por sua utilização na detecção de proteases2 mas é limitado em sua capacidade de obter mais informações. Zimografia é outro método de deteção de protease abrangente que pode ser usado para determinar o peso molecular de proteases3, mas não pode ser usado para examinar a especificidade de substrato. Especificidade de protease pode ser determinada por ensaios de espectrometria, usando substratos tais como p-nitroanilide4e ensaios fluorométrica, utilizando substratos de cumarina5 ou de ensaios de fluorescência ressonância energia transferência (FRET)6. Estes métodos permitem a detecção de single-especificidade de substratos contidos em um único poço. No presente estudo, a especificidade de protease de extratos de tecido é examinada sob várias condições, como estes extratos contêm várias proteases. Atividade de protease é regulada por vários fatores, incluindo pH, coenzimas, grupos prostético e força iônica. Recentemente, métodos baseados em proteômica têm sido usados para identificar a especificidade da protease; por exemplo, o método relatado por Biniossek et al. 7 usa a proteoma para determinar a especificidade de substrato mesmo em extratos brutos e permite a determinação exata da atividade de proteases que reconhecer várias sequências de aminoácidos8clivagem. No entanto, esse método não é adequado para a análise de várias amostras. Em contraste, o nosso método permite o processamento simultâneo de várias amostras e o uso de Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa para análise de amostra facilita a detecção rápida e fácil do clivada substratos.

Este artigo descreve um método para avaliar a especificidade do protease usando espectrometria de massa MALDI-TOF para medir o peso molecular de substratos exclusivos. As formas moleculares de substratos clivados, juntamente com seus pesos moleculares teóricos, são mostradas na Figura 1 e tabela 1. Estudos anteriores têm utilizados substratos contendo polyglycine espaçadores e biotina9; no entanto, estes substratos são falhos porque a sequência de polyglycine pode ser clivada por enzimas que reconhecem a sequência de glicina. Além disso, a alta afinidade entre avidina e biotina pode levar a uma taxa de recuperação de baixo. Para melhorar estes inconvenientes, neste estudo que nós sintetizado um substrato original, que era composto de polietileno glicol (PEG), iminobiotin e um aminoácido que pode identificar o local de clivagem (Figura 1). Para discriminar entre aminoácidos de peso moleculares similares, D-serina foi adicionado entre o espaçador de PEG e o aminoácido no site entalhado.

O N-terminal do substrato foi rotulado com iminobiotin, que permite a purificação da afinidade de amostras brutas. O uso de iminobiotin em vez de biotina é crítico; Biotina tem uma forte afinidade com avidina, que resulta em taxas de baixa recuperação de substratos de biotina-rotulado de resina avidin, enquanto a afinidade do iminobiotin para avidin pode ser alterada por pH. Iminobiotin-rotulado substratos irão ligar para avidin nas condições acima pH 9, enquanto avidin libera substratos iminobiotin-etiquetadas em condições abaixo de pH 4. Portanto, iminobiotin foi usado para purificação de afinidade10. Em resumo, nós descrevemos um protocolo detalhado para a detecção de especificidade de protease usando substratos exclusivos.

Protocol

Protocolos experimentais animais foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Nihon farmacêutico e realizados em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório da Universidade Nihon farmacêutico. O protocolo foi ajustado para extratos de tecido derivados de camundongos ICR. Camundongos ICR foram comprados de Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japão) 1. preparação do substrato Iminobiotin-etiquetado O substrato sofre a fase s…

Representative Results

Avaliação do método para a identificação da especificidade de protease por protease modelo A eficiência deste sistema foi avaliada usando TPCK-tripsina e protease V8, cujas especificidades do substrato foram obtidas. TPCK-tripsina e protease V8 foram estimados para clivar a sequência de aminoácidos no C-terminal dos resíduos lisina e arginina e no lado de carboxila do ácido aspártico e ácido glutâmico resíduos, respec…

Discussion

Este protocolo utiliza a espectrometria de massa MALDI-TOF para identificar a especificidade de protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido e facilmente pode ser ampliado para múltiplo processamento de amostra. Em particular, estamos manipulados pH para causar uma mudança na especificidade de substrato.

O método (ABC) complexo avidina-biotina, que tem sido amplamente utilizado em bioquímica devido à sua especificidade de ligação, foi utilizado em nosso protocolo. Devido a…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado em parte pelo Nihon farmacêutica Universidade bolsa de pesquisa da Universidade de Nihon farmacêutico (2016) e o MEXT KAKENHI Grant número JP17854179.

Materials

Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00102
N,N-dimethylformamide (DMF) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00185
piperidine Watanabe Chemical Co., Ltd. A00176
trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) WAKO Chemical 209-1483
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00067
1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00014
diisopropylethylamine (DIPEA) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00030
triisopropylsilane (TIS) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00170
ethanedithiol (EDT) Watanabe Chemical Co., Ltd. A00057
trifluoroacetic acid (TFA) Millipore S6612278 403
acetonitrile Kokusan Chemical 2153025
C18 cartridge column Waters WAT051910
poly(oxyethylene) octylphenyl ether WAKO Chemical 168-11805 Triton X-100
mixing homogenizer Kinematica PT3100 polytron homogenizer
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 Nakarai Chemical 094-09
glycerol Nakarai Chemical 170-18
N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin Sigma-Aldrich T1426
dimethyl sulfoxide (DMSO) WAKO Chemical 043-07216
streptavidin sepharose GE Healthcare 17-511-01
ZipTipC18 Millipore ZTC18S096
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich C2020
MALDI-TOF mass spectrometry Bruker Daltonics, Germany autoflex
2-iminobiotin Sigma-Aldrich I4632
Fmoc-amino acids Watanabe Chemical Co., Ltd.

参考文献

  1. Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
  2. Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
  3. Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
  4. Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
  5. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
  6. Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
  7. Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
  8. Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
  9. Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
  10. Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
  11. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  12. Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
  13. Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
  14. Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).

Play Video

記事を引用
Yamamoto, H., Sawaguchi, Y., Kimura, M. The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes. J. Vis. Exp. (135), e57469, doi:10.3791/57469 (2018).

View Video