MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

プロテアーゼはタンパク質を切断し生理学的なプロセスを規制する、特定の時間と場所でプロテアーゼ活性の開始は規制¹。したがって、式と規制されてローカル組織の活動を識別するためにプロテアーゼを検出する手法を開発することが重要です。方法を提案するプロテアーゼの検出と並行してプロテアーゼの特異性を識別するために本研究の目的です。

プロテアーゼの特異性を検出するためのいくつかの方法があります。着色方法がプロテアーゼ²の検出に使用するためよく知られている詳細情報を取得する能力が限られています。ザイモグラフィーはプロテアーゼ³分子量を決定するため使用することができます別の包括的なプロテアーゼ検出法が、基質特異性を調べるには使用できません。プロテアーゼの特異性は、p-ニトロアニリド水解活性⁴など基板を用いた分光測定法と蛍光アッセイ、クマリン基板⁵または⁶蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) 試金を使用してによって決定できます。これらのメソッドは、単一の井戸に含まれる基質の単一特異性検出を有効にします。本研究ではこれらの抽出物を含む複数のプロテアーゼ、さまざまな条件の下でティッシュ エキスのプロテアーゼの特異性を検討します。プロテアーゼ活性は、pH、補酵素、補欠分子族とイオン強度を含むいくつかの要因によって調整されます。プロテオミクスに基づく方法がプロテアーゼの特異性; を識別するために使用されている最近、たとえば、メソッドは Biniossekらによって報告されました。⁷プロテオーム粗抽出物中も基質特異性を決定し、複数アミノ酸シーケンス⁸を認識プロテアーゼの切断活性の正確な定量をことができます。ただし、このメソッドは、多数の試料の分析に適してではありません。対照的に、この手法により複数のサンプルの同時処理および使用のマトリックス レーザー脱離イオン化飛行時間 (MALDI-TOF) サンプル分析のための質量分析法、劈開の簡便・迅速な検出を容易に基板。

このペーパーは、ユニークな基質の分子量を測定する MALDI-TOF 質量分析法を用いたプロテアーゼの特異性を評価する方法を説明します。と一緒に彼らの理論分子量の劈開基板の分子形態は、図 1と表 1に表示されます。以前の研究は、ポリグリシン スペーサーとビオチン⁹; を含む培地を使用しています。ただし、ポリグリシン シーケンスは、グリシンのシーケンスを認識する酵素によって裂かれることがありますので、このような基板が欠点があります。さらに、低回収率アビジンとビオチンとの親和性が高い可能性があります。我々 は、ポリエチレング リコール (PEG)、iminobiotin、および胸の谷間サイト (図 1) を識別することができるアミノ酸で構成されたユニークな基板を合成したこの研究では、これらの欠点を改良します。同じような分子量のアミノ酸を区別するには、PEG スペーサーと劈開サイトでアミノ酸 D-セリンをされました。

基質の N 末端は、原油由来の親和性の浄化を可能にする iminobiotin が付いていた。ビオチンではなく iminobiotin の使用が重要です。ビオチン、アビジンは、ビオチン標識アビジン樹脂基板上の低回収率アビジンの iminobiotin の親和性は pH によって変更できます、結果強い親和性。Iminobiotin というラベルの付いた基板は、アビジンは pH 4 以下の条件で基板上の iminobiotin ラベルを解放しながら pH 9、上記の条件でアビジンにバインドします。したがって、iminobiotin は、アフィニティ精製¹⁰に使われました。要約すると、ユニークな基板を用いたプロテアーゼの特異性を検出するための詳しいプロトコルについて述べる。