De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Proteasen reguleren fysiologische processen door het splijten van eiwitten, en de inleiding van protease-activiteit op bepaalde tijdstippen en locaties is gereglementeerde¹. Het is daarom belangrijk om te identificeren van de expressie en de activiteit van weefsels die lokaal worden geregeld, en een nieuwe methode voor het detecteren van proteasen te ontwikkelen. De methode voorgesteld deze studie wil identificeren protease specificiteit parallel aan het opsporen van proteasen.

Er zijn enkele methoden voor het opsporen van protease specificiteit. De azocasein methode is bekend om het gebruik ervan in de opsporing van proteasen² maar is beperkt in zijn vermogen om verdere informatie te verkrijgen. Zymography is een andere uitgebreide protease-detectiemethode die kan worden gebruikt om te bepalen van het molecuulgewicht van proteasen³, maar het kan niet worden gebruikt voor het onderzoeken van substraat specificiteit. Protease specificiteit kan worden bepaald door spectrometrische assays, gebruik van substraten zoals p-nitroanilide⁴, en fluorimetrische vitrotests, met behulp van cumarine substraten⁵ of fluorescentie Resonance Energy Transfer (FRET) testen⁶. Deze methoden inschakelen single-specificiteit detectie van substraten die zijn opgenomen in een enkele goed. In de huidige studie, wordt de protease-specificiteit van extracten van weefsel onderzocht onder verschillende omstandigheden, zoals deze extracten meerdere proteasen bevatten. Protease-activiteit wordt geregeld door verschillende factoren, inclusief pH, coënzymen en prosthetic groepen ion sterkte. Onlangs, proteomics gebaseerde methoden zijn gebruikt voor het identificeren van protease specificiteit; bijvoorbeeld de methode gerapporteerd door Biniossek et al. ⁷ de Proteoom gebruikt om te bepalen van substraat specificiteit zelfs in grove extracten en nauwkeurige bepaling van de activiteit van de splitsing van proteasen die meerdere aminozuur sequenties^{8 herkent}staat. Deze methode is echter niet geschikt voor de analyse van de talloze voorbeelden. Daarentegen onze methode maakt de gelijktijdige verwerking van meerdere monsters, en het gebruik van de Matrix-Assisted Laser desorptie/ionisatie Time-of-Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie voor analyse van monster vergemakkelijkt een snelle en gemakkelijke opsporing van de gekloofd substraten.

Dit document schetst een methode om te evalueren van protease specificiteit met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF voor het meten van het molecuulgewicht van unieke substraten. De moleculaire vormen van gekloofd substraten, samen met hun theoretische molecuulgewichten, worden weergegeven in Figuur 1 jp tabel 1. Eerdere studies hebben gebruik gemaakt van substraten met polyglycine spacers en biotine⁹; echter zijn deze substraten gebrekkig omdat de volgorde van de polyglycine kan worden cleaved door enzymen die de glycine-volgorde herkent. Daarnaast is de hoge affiniteit tussen avidin en biotine kan leiden tot een lage opbrengst. Om op deze nadelen, in deze studie we gesynthetiseerd een uniek substraat, die bestond van polyethyleenglycol (PEG), iminobiotin en een aminozuur dat de breukzijde (Figuur 1 identificeren kon). Om te discrimineren tussen aminozuren gelijkaardige molecuulgewichten, werd D-serine toegevoegd tussen de pin spacer en het aminozuur op de gekloofd site.

De N-terminal van het substraat werd aangeduid met iminobiotin, waarmee de zuivering van de affiniteit van ruwe monsters. Het gebruik van iminobiotin in plaats van Biotine is van cruciaal belang; Biotine heeft een sterke affiniteit met avidin, wat in terugwinning van de lage tarieven van biotine-geëtiketteerden substraten uit avidin hars, resulteert terwijl iminobiotin de affiniteit voor avidin kan worden gewijzigd door pH. Iminobiotin-geëtiketteerden substraten zal binden aan de avidin in omstandigheden boven pH 9, terwijl avidin releases iminobiotin-geëtiketteerden substraten in voorwaarden hieronder pH 4. Daarom werd iminobiotin gebruikt voor affiniteit zuivering¹⁰. In samenvatting beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het opsporen van protease specificiteit met behulp van unieke substraten.