De Novo Generazione di cellule staminali somatiche da YAP/TAZ

Tutte le procedure degli animali sono state effettuate aderendo alle nostre linee guida istituzionali e approvato da OPBA e il Ministero della salute 1. generazione di mammaria indotta da YAP cellule staminali-simili (yMaSCs) Nota: Tutte le composizioni di media e soluzione per la sezione 1 sono specificate nella tabella 1. Isolamento di popolazioni di cellule mammario primario Preparare sotto una cappa di coltura delle cellule: bisturi monouso, soluzione di ialuronidasi, dissociazione medium, emolitica soluzione, soluzione di ordinamento, collagene rivestimento soluzione, soluzione Ca2 + chelante, lavaggio medio #1, lavare medium #2, soluzione dispase, mammario coltura 2D, ghiaccio freddo HBSS/PS. Per un tipico esperimento, sacrificare 10 topi femminili (sia CD-1 del ceppo C57BL/6), 8-12 settimane vecchie di dislocazione cervicale. Sterilizzare l’addome con abbondanti soluzione di etanolo 70% prima della dissezione. Sezionare le ghiandole mammarie un’incisione a forma di Y lungo la pelle dell’addome e separando accuratamente le ghiandole dal peritoneum tirando delicatamente con una pinza Dumont. Mettere le ghiandole dissecate in un non-cellula adesivo con 10 mL di ghiaccio freddo HBSS/PS (20 ghiandole per ogni piatto), assicurandosi di non riporto alcun frammento di pelle. Sotto una cappa di coltura del tessuto, lavare una volta ogni ghiandola in 10 mL di fresco HBSS/PS e metterli in un piatto adesivo per vuoto non-cellula (20 ghiandole per ogni piatto). Non utilizzare le piastre di coltura del tessuto, come le cellule tendono a bastone a loro, provocando una perdita ingente di materiale. Tritare finemente le ghiandole mammarie con bisturi fino ad ottenuta una miscela omogenea di frammenti di 1 mm3 . Recuperare il tessuto macinato da ogni piatto in 10 mL di medium di dissociazione con una pipetta sierologica di 25 mL per evitare intasamenti e trasferire la sospensione in una provetta conica 50 mL x almeno 5 per disaggregare tessuto ciuffi di pipettaggio.Nota: Per una digestione efficiente, corretta macinazione del tessuto nel passaggio 1.1.5 è cruciale. Incubare per 1h a 37 ° C con agitazione vigorosa continuo. Dopo 1 h, controllare l’omogeneizzato e prolungare l’incubazione di 10 min se ciuffi sono ancora presenti. Rotazione verso il basso il tessuto digerito a 400 x g per 5 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di tessuto in 3 mL di soluzione emolitica e incubare per 3 minuti sul ghiaccio.Nota: Hemolysis è un trattamento piuttosto duro, in modo rigoroso tempismo è cruciale in questa fase. Lavare le cellule con 10 mL di mezzo di lavaggio #1, gira giù il tessuto digerito a 400 x g per 5 min e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di tessuto in 10 mL di lavaggio medio # 2 e piastra in piastre di coltura di tessuto di 10 cm. Incubare i piatti per 1 h a 37 ° C in un’incubatrice di cultura cellulare.Nota: Questo passaggio permetterà la rimozione della maggior parte dei fibroblasti, che aderisca alla piastra di coltura. Recuperare la sospensione cellulare dai piatti e versare in una provetta conica da 50 mL. Spin a 400 x g per 5 min ed eliminare il supernatante. Lavare la pallina due volte in 10 mL di Ca2 + soluzione di chelatazione di rotazione verso il basso a 400 x g per 5 minuti ogni volta. Risospendere il pellet in 5 mL di 0,25% tripsina/EDTA e incubare per 5 min a 37 ° C. Aggiungere 5 mL di soluzione di dispase sulla cima la soluzione di tripsina e supplemento con dnasi I 1μg/mL. Pipettare su e giù per almeno 5 x attraverso una 1 mL-punta a disaggregare DNA ciuffi e incubare per 10 min a 37 ° C, agitando ogni 3 min. Aggiungere 10 mL di lavaggio medio #2 e filtro in una nuova provetta conica 50 mL attraverso un colino di cella 40 μm. Rotazione verso il basso la sospensione cellulare a 400 x g per 5 min e scartare il surnatante, assicurandosi di eliminare tutto il liquido. Purificazione delle cellule epiteliali mammarie di FACS Preparare la miscela di anticorpo aggiungendo 10 μL Lin (anticorpo di topo lignaggio cocktail), 12 μL anti-CD326 (Ep-CAM), ad una concentrazione finale di 30 ng/mL, 10 μL anti-CD49f, ad una concentrazione finale di 25 ng/mL, 10 μL anti-CD61, ad una concentrazione finale di 10 ng/mL , 2,5 µ l anti-CD29, ad una concentrazione finale di 2,5 ng/mL.Nota: da 1,3 questo passo per passo, operare sempre al buio, per evitare lo sbiancamento degli anticorpi fluorescente contrassegnati. Per ogni pallina: Tenere un piccolo numero di cellule (immergendo una mancia di 100 μL nel pellet) in un tubo separato. Risospendere le cellule in 500 μL di soluzione in un tubo di FACS di ordinamento e mantenere il ghiaccio come il campione senza etichetta per la procedura di FACS. Ogni risospendere in 200 μL di lavaggio medio #1, aggiungere 44,5 μL di miscela di anticorpo, pipettare accuratamente e incubare per 30 min in ghiaccio al buio. Diluire la sospensione cellulare in 10 mL di mezzo di lavaggio #1, gira giù a 400 x g per 5 min e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di soluzione di ordinamento e filtro attraverso un tappo-colino FACS materiali procedere al FACS-separazione delle popolazioni di cellule (come in Figura 1B). Prima di eseguire il protocollo di FACS multicolor, assicurarsi di correggere per le possibili ripercussioni di ogni fluorocromo in ciascuno degli altri. Per effettuare questa operazione, Incubare ogni anticorpo coniugato fluoroforo separatamente con una sospensione cellulare e misurare valori di sovrapposizione spettrale per tutti i fluorofori e in tutti i rivelatori, tramite controlli di colore unico, al fine di creare una matrice di incremento retributivo.Nota: In questo esperimento, sorter dotata di 85 μm ugello è stato impiegato. Una preparazione tipica da 10 topi femminili produrrà circa 800.000 cellule LD. Procedere alla filtrazione secondaria se grumi si formano durante la procedura di FACS. Semina delle cellule mammarie primarie di LD Durante la procedura di FACS ricoprire una piastra di coltura del tessuto ben multi con collagene ho rivestimento soluzione. Incubare per 1h a 37 ° C, 5% CO2 in un’incubatrice di coltura cellulare. Rimuovere la soluzione di rivestimento e lavare con lavaggio medio #1 poco prima di placcatura. Lavare le cellule recuperate dalla procedura di FACS con 10 mL di soluzione di lavaggio #1, gira giù 400 x g per 5 min ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura 2D mammaria (500 µ l/pozzetto) e piastra di collagene trattato. Lasciare che le celle di sedersi in un’incubatrice di coltura cellulare per 48 h consentire collegamento corretto delle cellule e la diffusione.Nota: Per un tipico ordinamento da 10 topi femminili, 6-8 pozzetti di una piastra ben 24 pozzetti multi produrrà una densità cellulare ottimale (100 000 cellule/pozzetto). Induzione di yMaSCs (indotta da YAP mammaria cellule staminali)Nota: Da questo punto in poi, tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni di BSL-2. Preparare il supporto di Colonia mammaria. Appena aggiungere la matrice della membrana basale al mezzo appena prima della semina delle cellule. Per l’induzione di YAP-indotta di cellule staminali mammarie (yMaSCs), trasduce le cellule primarie di LD da infezione lentivirale miscelando un volume del surnatante virale FUdeltaGW-rtTA, un volume del surnatante FUW-tetO-YAP (o TAZ), con due volumi di privo di siero mammaria Terreno di coltura 2D concentrazioni 2x di integratori, in un volume totale di 500 mL. Incubare le cellule con i surnatanti lentivirali per 48 h. Per una tipica preparazione lentivirale, fare riferimento al protocollo di linea22. Dopo l’infezione, lavare le cellule aderenti e trattare con terreno di coltura 2D mammaria completato con la doxiciclina 2 µ g/mL di indurre l’espressione genica esogeno YAP (o TAZ). Utilizzare le cellule infettate con empty, vettori che esprimono EGFP o YAPS94A o cellule infettate con viscoelastico YAP (o TAZ) vettori, ma lasciato senza doxiciclina come controlli negativi.Nota: Successo infezione può essere convalidato mediante qRT-PCR con primer specifici per umani YAP transgene, come descritto in precedenza1. Dopo 7 giorni di induzione con doxiciclina, staccare le cellule aderenti tramite incubazione con 0,05% tripsina/EDTA (150 μL/pozzetto) per 10 min a 37 ° C; smettere di trypsinization diluendo 1:5 a lavaggio medio #2 (600 μL/pozzetto) e contare le celle. Risospendere le cellule in mezzo Colonia mammaria (1 mL per ciascun pozzetto), completate con 2 μg/mL doxiciclina e seme ad una densità di clonogenic di 1.000 cellule per pozzetto in piastre di ancoraggio 24 pozzetti ultrabasso.Nota: Assicurarsi che il supporto di Colonia mammaria è ghiacciata al momento dell’aggiunta di matrice della membrana dello scantinato. La matrice della membrana basale dovrà sempre essere conservata a-20 ° C all’arrivo e scongelata lentamente a 4 ° C durante la notte; una volta scongelato, deve sempre essere gestita sul ghiaccio, secondo le linee guida del produttore. Una volta YAP-LD cellule esprimenti iniziare a proliferare e crescere come MaSC-come colonie in sospensione (yMaSC colonie) (14 giorni dopo la semina), contare ed elaborare per ulteriori analisi (Figura 1).Nota: Le cellule di controllo negativo (come al punto 1.4.3) rimarrà come singole cellule. Ricostituire la cultura con mezzo fresco di Colonia mammaria ogni 72 ore durante i 14 giorni di sviluppo della colonia di yMaSC; per fare questo preparare un’aliquota del mezzo di Colonia mammario senza matrice della membrana dello scantinato di 5%, completati con concentrazione 10x di integratori e aggiungere 01:10 del volume totale in ciascun pozzetto (ad es. 100 μL in 1 mL di terreno totale), per evitare eccessiva diluizione di la sospensione di matrice. Sub-coltura di yMaSCs Recuperare le colonie primarie dal mezzo di Colonia mammaria, quindi dissociare e reinizializzare.Nota: colonie di yMaSC derivati da cellule riprogrammate YAP LD acquisiscono capacità di auto-rinnovamento e possono essere con successo Sub-coltivate senza ulteriore somministrazione di doxiciclina (cioè, indipendentemente dall’espressione di YAP/TAZ transgenici). Preparare, sotto una cappa di cultura cellulare, Colonia mammario medio come descritto al punto 1.4.1 e mammario organoid medio. Raccogliere ogni campione ed incubare il volume in eccesso (10:1) di ghiaccio freddo HBSS per 1h sul ghiaccio, al fine di solubilizzare la matrice della membrana basale. Lavare colonie 3 x mediante centrifugazione a 180 x g per 5 min e risospendere in ghiaccio freddo HBSS. Incubare le colonie in tripsina/EDTA 0,05% per 10 min a 37 ° C per ottenere una sospensione di singola cellula. Pipetta colonie su e giù per 10 volte con una punta di p1000 per garantire dissociazione completa a livello di singola cellula. Conteggio e reseeding cellule nel mezzo di Colonia mammaria (1 mL per ciascun pozzetto) senza doxiciclina a una densità di clonogenic di 1.000 cellule per pozzetto in piastre di ancoraggio 24 pozzetti ultrabasso. Ripetere questo passaggio procedura ogni 10-14 giorni per valutare il auto-rinnovamento. Prima il terzo passaggio, passaggio yMaSC colonie in condizioni di coltura organoid, per migliorare yMaSC espansione e per consentire la formazione di mini-ghiandole, che si auto-organizzano in un epitelio bilayered strettamente rievocativo della ghiandola mammaria in vivo organizzazione istologica. Recuperare colonie dal mezzo Colonia mammaria come descritto al punto 1.5.3 a 1.5.4. Risospendere le colonie nel fattore di crescita di 100% ha ridotto la matrice della membrana basale, valutando la possibilità di replate un massimo di 20-25 colonie per ciascun pozzetto di una piastra di attacco 24 pozzetti ultrabasso in 150 µ l della matrice. Incubare le piastre in un’incubatrice di coltura cellulare per 40 min a 37 ° C e lasciare che la matrice della membrana basale solidificare e poi sovrapporre i gel con 500 μL del mezzo mammaria organoid. Dopo pochi giorni si verifica per la formazione di colonie di forma in erba organoids (Figura 1E). Dopo 10-14 giorni, passaggio o processo organoids per ulteriori analisi. A passage organoids culture, recuperare organoids raccolta ogni campione e incubando in volume in eccesso (10:1) di ghiaccio freddo HBSS per 1h sul ghiaccio, al fine di solubilizzare la matrice della membrana basale. Lavare organoids 3 x di spin giù a 180 x g per 5 min e risospendere in ghiaccio freddo HBSS. Incubare organoids in tripsina/EDTA 0,05% per 10 min a 37 ° C per ottenere una sospensione di singola cellula. Pipetta organoids su e giù per 10 volte con una punta di p1000 per garantire dissociazione completa a livello di singola cellula. Reinizializzare una sospensione singola cella in una goccia di matrice di fattore di crescita del 100% ridotta della membrana basale (150 μL per ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti ultrabasso allegato). Lasciate che la matrice della membrana basale formano un gel incubando 40 min a 37 ° C in un’incubatrice di coltura delle cellule e sovrapporre i gel con 500 μL del mezzo mammaria organoid.Nota: yMaSC organoids possono essere crioconservati recuperando dalla cultura di matrice della membrana dello scantinato 100% come al punto 1.5.13, evitando trypsinization. Conservare nel mammario organoid supplementato con 10% DMSO. Congelare rapidamente il organoids yMaSC a-80 ° C e quindi conservati in azoto liquido. 2. generazione di yDucts Nota: Tutte le composizioni di media e soluzione per la sezione 2 sono specificate nella tabella 2. Isolamento dei acini pancreatici primari Posizionare le forbici e pinze per dissezione nel 70% EtOH e preparare sotto un cappuccio acinose cultura medium della coltura cellulare, 15 mL per ogni mouse; mezzo di recupero acinose, 60 mL per ogni mouse; PBS/PS; collagenasi di soluzione di riserva; collagenasi ho soluzione A, 15 mL per ogni mouse; neutralizzata la coda di topo collagene ho soluzione. Neutralizzare il collagene della coda di ratto che a pH = 7, regolando prima con 0,1 N NaOH per tamponare l’acido acetico in cui il collagene è dissolto e poi con 10N HCl. Diluire a 2,5 mg/mL in PBS/PS tenere il collagene di coda di ratto, io e tutti i reagenti sul ghiaccio per neutralizzarlo. 6 a 9 settimane topi del genotipo corretto il sacrificio. Posizionare ogni mouse sul dorso e lavare l’addome con una soluzione di etanolo 70%. Fare un’incisione longitudinale lungo la parete addominale. Individuare e sezionare il pancreas (utilizzando la milza come guida) e metterlo in un piatto di adesivo non cellula 10cm in 10 mL di ghiaccio freddo PBS/PS trasferire i piatti immediatamente sotto un cofano di cultura cellulare. Da questo punto in poi, lavorare sempre sotto una cappa di cultura cellulare. Ogni pancreas in una nuova non-cellula di trasferimento adesivo piatto precedentemente riempito con 7 mL di collagenasi ho soluzione A. Tritare rapidamente ogni pancreas con una coppia di bisturi monouso, per ottenere una sospensione omogenea del tessuto di frammenti di3 circa 1 mm.Nota: È importante notare che questa procedura dovrebbe richiedere non più di 2 min per la vitalità cellulare ottimale. Incubare il piatto per digestione della collagenosi a 37 ° C, 5% CO2 in un’incubatrice di coltura cellulare per 10 minuti, scuotendo ogni 3 min per assicurare la digestione di tessuto omogeneo. Recuperare il tessuto digerito in una provetta conica da 50 mL (uno per ogni pancreas), lavare il piatto con 10 mL di terreno di lavaggio acinose e posizionarlo nello stesso tubo 50 mL conica, pipettaggio digerito tessuto su e giù per non più di 3 volte. Rotazione verso il basso il tessuto digerito per 5 min a 100 x g a 18 ° C ed eliminare il surnatante.Nota: Rotazione verso il basso le cellule a 18 ° C per ridurre l’attività della collagenosi durante questo passaggio. Risospendere il tessuto della pallina in 7 mL di collagenasi soluzione A e versare questa soluzione in un nuovo piatto di adesivo non cellula 10 cm. Incubare il piatto per un secondo ciclo di digestione della collagenosi a 37 ° C per 10 min come descritto al punto 2.1.5, scuotendo ogni 3 min per assicurare la digestione di tessuto omogeneo. Nel frattempo, preparare una provetta conica pulito 50 mL per ogni pancreas condita con un colino di cella 100 μm. Recuperare il tessuto digerito e passare attraverso il filtro di cella di 100 μm dalla macerazione del tessuto con un pistone della siringa sterile da 10 mL (assicurarsi di premere delicatamente verso il basso il tessuto, evitando le forze di taglio tangenziale alla superficie del filtro). Lavare il piatto con 10 mL di terreno di lavaggio acinose e passare questo 10ml con la stessa colino di cella 100 μm. Rotazione verso il basso il tessuto digerito per 5 min a 100 x g a 18 ° C ed eliminare il surnatante. Recuperare la pallina di tessuto con 10 mL di terreno di lavaggio acinose. Trasferire la soluzione di cella in una provetta conica da 50 mL già contenente ulteriori 10 mL di medium fresco lavare acinose, evitando eccessivi di pipettaggio per risospensione del pellet. Rotazione verso il basso il tessuto digerito per 5 min a 100 x g a 18 ° C ed eliminare il surnatante. Attentamente risospendere il tessuto digerito in 6 mL di terreno di recupero acinose e distribuirlo in 2 pozzetti della piastra ben coltura tissutale di multi 6-pozzetti, 3 mL ciascuno. Sotto un microscopio stereoscopico attentamente valutare la qualità dell’isolamento acinosa, che appaiono come una sospensione omogenea di acinose cluster, con una percentuale minore di singole cellule (Vedi fig. 2B); rimuovere qualsiasi tessuto grande ciuffi eventualmente presentano (in genere visibile anche ad occhio nudo), pipettando li fuori della soluzione. Semina dei acini pancreatici primari Incubare i cluster acinosi digeriti a 37 ° C in un’incubatrice di coltura cellulare per 2 h, per consentire il recupero delle cellule. Durante il cappotto di recupero cellulare 48 pozzetti multi pozzi con 100 μL di collagene neutralizzati ratto coda ho e incubare per 1h a 37 ° C in un’incubatrice di coltura cellulare per consentire un cuscino di idrogel per modulo. Dopo 2 h di recupero delle cellule, raccogliere sospensione di cellule acinose in un tubo conico, rotazione verso il basso per 5 min a 100 x g a 18 ° C ed eliminare il surnatante. Risospendere i acini nel volume appropriato di coltura acinosa (150 μL per pozzetto di una piastra di coltura del tessuto ben 48). Ogni seme dissociato pancreas in 16 pozzetti per ottenere una densità ottima (100-120 acinose cluster/pozzetto). Diluire questa sospensione acinosa con un volume uguale di collagene della coda di ratto neutralizzati ho soluzione, mantenendo i tubi sul ghiaccio. Mescolare accuratamente e rapidamente seme la sospensione cellulare in cima all’ammortizzatore di collagene descritto in 2.2.2 (300 μL per pozzetto di una piastra di coltura del tessuto ben 48 multi ben). Incubare 1h a 37 ° C in un’incubatrice di coltura cellulare per consentire un idrogel al form. Induzione dei organoids del pancreas Sovrapposizione di idrogeli di collagene con 500 μL di coltura acinose completati con la doxiciclina 2 μg/ml per induzione YAP-dipendente di pancreas organoids da R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A topi; controlli negativi sono forniti da wt cellule coltivate nelle stesse condizioni o R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A cellule coltivate in assenza di doxiciclina. Le cellule acinose coltura in terreno di coltura acinose completati con doxiciclina di 2 μg/mL per 5-7 giorni rinfrescante terreno di coltura (300 μL/pozzetto) ogni 48 h e in seguito organoid formazione da cambiamenti morfologici verso cisti formando strutture ductal-like ( Figura 2). Una volta organoids sono formate, le cellule possono essere attraversate in condizioni di coltura organoid pancreatico o raccolte per ulteriori analisi (ad es.: estrazione del RNA, immunofluorescenza). Sub-coltura dei organoids del pancreas Per valutare la loro capacità di auto-rinnovamento, clonally passage organoids pancreatica indotta da YAP (yDucts) in idrogeli di matrice tridimensionale della membrana dello scantinato (condizioni di coltura organoid pancreatico) indipendentemente dal rifornimento di YAP/TAZ esogeno (cioè. indipendentemente dalla somministrazione di doxiciclina). Preparare la tripsina 0,05%/EDTA; matrice di ridotta della membrana basale del fattore di crescita del 100%; Pancreatico Organoid Medium e la collagenosi ho soluzione B. Preparare un 15 mL conica tubo con 4 mL di collagenasi I soluzione B per ciascun pozzetto per essere attraversate. Scartare il terreno di coltura, attentamente estrarre idrogeli dai pozzi di aspirazione delicata e trasferirli a tubi conici. Incubare le provette a 37 ° C per 30 min, con continua agitazione vigorosa per consentire la completa digestione della matrice del collagene (controllare ogni 10 min fino a quando l’idrogel è completamente solubilizzata). Rotazione verso il basso cellule recuperate a 750 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante. Incubare le cellule recuperate in 1 mL di tripsina 0,05%/EDTA per 10 min a 37 ° C per ottenere una sospensione di singola cellula. Diluire la tripsina con 9 mL di PBS 1 x, rotazione verso il basso a 750 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in matrice di ridotta della membrana basale di ghiaccio freddo fattore di crescita e seme in piastre di fissaggio ultra-basso (in genere una goccia di 150 µ l in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti). Lasciate che l’idrogel di matrice della membrana dello scantinato solidificare incubando le piastre in un’incubatrice di coltura cellulare 40 min a 37 ° C e poi sovrapporre con pancreatico Organoid medio (500 μL per pozzetto). yDucts crescerà come ciste-come organoids in 7-10 giorni (Figura 2D). Per ulteriore passaggio organoids può essere rimosso dalla matrice della membrana basale tramite incubazione in ghiaccio freddo PBS 1 x per 30 minuti, seguita da lavaggio 3 volte da spin giù a 180 x g per 5 min e risospensione in PBS freddo ghiaccio 1 x per evitare il riporto di matrice. Organoids sono poi dissociato con tripsina 0,05% per 10 minuti ottenere una sospensione di cellule singole e reseeding nella matrice della membrana basale fresco e quindi sovrapposti con pancreatico Organoid Medium (come 2.4.7-2.4.8). yDuct organoids possono essere crioconservati in azoto liquido recuperando dalla cultura di matrice della membrana dello scantinato di 100% come in passo 2.4.9, evitando trypsinization, e la memorizzazione in pancreas Organoid Medium completato con 10% DMSO. yDuct organoids sono rapidamente congelato a-80 ° c e quindi conservati in azoto liquido.