从头用狂吠/狂暴法生成体细胞干细胞

所有动物程序都遵循我们的制度准则, 并经 OPBA 和卫生部批准。 1. 狂吠诱导的乳腺干样细胞的生成 (yMaSCs) 注意: 1 节的所有媒体和解决方案组合都在表 1中指定。 原发性乳腺细胞种群的分离 在细胞培养罩下准备: 一次性手术刀, 透明质酸酶溶液, 离解介质, 溶血溶液, 分选溶液, 胶原 i 涂层溶液, Ca2 +螯合液, 洗涤介质 #1, 洗涤介质 #2, 酶溶液,乳房2D 培养基, 冰冷 HBSS/PS。 对于一个典型的实验, 牺牲10只雌性小鼠 (CD-1 C57BL/6 菌株), 8-12 周大的颈椎脱位。在解剖前用丰富的70% 乙醇溶液对腹部进行消毒。 解剖乳腺通过做一个 Y 形切口沿腹部皮肤和仔细地分离腺体从腹膜通过轻轻地拉扯与。将解剖腺体放置在非细胞粘附盘中, 10 毫升冰冷 HBSS/PS (每道菜20个腺体), 确保不携带任何皮肤碎片。 在组织培养罩下, 用10毫升新鲜的 HBSS/PS 洗涤每个腺体, 并将它们放在一个空的非细胞粘附盘中 (每道菜的20个腺体)。不要使用组织培养板, 因为细胞将倾向于坚持他们造成重大损失的材料。 用手术刀将乳腺细碎, 直到获得1毫米3片段的均匀混合。用25毫升血清学吸管从每道菜中回收10毫升的分离培养基中的碎组织, 以避免堵塞和转移悬浮在50毫升圆锥管吹打至少 5x, 以分类组织团簇。注意: 为了有效消化, 在步骤1.1.5 中适当切碎组织是至关重要的。 在37摄氏度孵育1小时, 持续剧烈晃动。1小时后, 检查匀浆和延长孵化10分钟, 如果团簇仍然存在。在室温下将所消化的组织在 400 x g 处旋转5分钟, 然后丢弃上清。并用重悬3毫升溶血溶液中的组织颗粒, 在冰上孵化3分钟。注意: 溶血是一个相当苛刻的治疗, 所以严格的时间是关键的这一步。 用10毫升洗涤培养基 #1 冲洗细胞, 将所消化的组织在 400 x g 处旋转5分钟, 然后丢弃上清。并用重悬10毫升的洗涤培养基2和板在10厘米组织培养皿中的组织颗粒。在细胞培养孵化器中孵化1小时37摄氏度的菜肴。注意: 这一步将允许去除大多数成纤维细胞, 那应该坚持培养皿。 从盘子里恢复细胞悬浮液, 倒入50毫升锥形管。旋转 400 x g 5 分钟, 并消除上清。每次在10毫升的 Ca2 +螯合溶液中以 400 x g 为5分钟, 将颗粒清洗两次。并用重悬在5毫升0.25% 胰蛋白酶/EDTA 和孵化5分钟在37摄氏度。 在胰蛋白酶溶液的顶端加入5毫升的酶溶液, 并补充 DNase I 1μg/毫升。吸管向上和向下至少5x 通过1毫升尖端, 以分类 DNA 团簇和孵化10分钟37摄氏度, 颤抖每3分钟。 添加10毫升的洗涤介质 #2 和过滤器在一个新的50毫升圆锥管通过40微米细胞过滤。将细胞悬浮在 400 x g 处旋转5分钟, 然后丢弃上清, 确保清除所有液体。 利用资产管制仪纯化乳腺上皮细胞 加入 10 ul 林 (小鼠血统抗体鸡尾酒), 准备抗体组合, 12 ul 反 CD326 (Ep 凸轮), 到最后集中 30 ng/毫升, 10 ul 反 CD49f, 到最后浓度 25 ng/毫升, 10 ul 反 CD61, 最终浓度 10 ng/毫升, 2.5 ul 抗 CD29, 最终浓度为 2.5 ng/毫升。注意: 从这个步骤到步骤 1.3, 总是在黑暗中操作, 以避免漂白荧光标记的抗体. 对于每个颗粒: 保持少量的细胞 (通过蘸 100 ul 尖端在小球) 在一个单独的管。并用重悬在 500 ul 的分类溶液中的细胞, 并保持在冰作为一个未标记的样品的外地资产管制程序。 并用重悬每个颗粒在 200 ul 的洗涤介质 #1, 添加 44.5 ul 的抗体混合, 吸管彻底和孵化30分钟冰在黑暗中。稀释细胞悬浮在10毫升洗涤介质 #1, 在 400 x g 下旋转5分钟, 并丢弃上清。 并用重悬2毫升的分选溶液中的细胞颗粒, 并通过帽过滤器地铁或进行过滤, 进行细胞群分离(如图 1B)。在执行多色的流化程序协议之前, 一定要纠正每个 fluorochrome 的可能溢出。要做到这一点, 每个荧光共轭抗体单独孵化与细胞悬浮和测量光谱重叠值为所有显影和在所有探测器, 通过单色控制, 以创建补偿矩阵。注: 本实验采用85微米喷嘴的分拣机。来自10只雌性小鼠的典型制剂将产生大约80万个 LD 细胞。进行二次过滤, 如果团簇形式在外地资产管制程序。 原发性乳腺 LD 细胞的播种 在操作过程中, 用胶原 i 涂层溶液涂上多井组织培养板。孵育1小时在37°c, 5% CO2在细胞培养孵化器。取出涂层溶液, 用洗涤介质 #1 电镀前清洗。 用10毫升的洗涤液 #1, 将 400 x g 旋转到5分钟, 并消除上清, 从操作过程中恢复的洗涤细胞。并用重悬乳腺2D 培养基中的细胞颗粒 (500 µL/井) 和胶原治疗钢板。让细胞在细胞培养孵化器中坐48小时, 以便适当的细胞附着和传播。注: 对于10只雌性小鼠的典型排序, 24 井多井板6-8 井将产生最佳细胞密度 (100 000 细胞/井)。 yMaSCs (狂吠诱导的乳腺干细胞) 的诱导注意: 从这一步开始, 所有程序都应在 BSL-2 条件下执行。 准备乳房菌落培养基。刚在细胞播种前将基底膜基质添加到培养基中。 对狂吠诱导的乳腺干细胞 (yMaSCs) 的诱导, 传感器慢病毒载体感染的主要 LD 细胞, 混合一量 FUdeltaGW rtTA 病毒上清, 一容积的福网-tetO-狂吠 (或狂暴) 上清, 两卷无血清乳房2D 培养基2x 浓度的补充剂, 总体积为500毫升。用慢病毒载体上清液孵化细胞48小时。对于典型的慢病毒载体准备, 请参阅联机协议22。 感染后, 用2µg/毫升强力霉素, 用乳腺2D 培养基对黏附细胞进行冲洗, 以诱导外源性狂吠 (或狂暴) 基因表达。使用细胞感染的空, EGFP 或 YAPS94A 表达载体, 或细胞感染诱导狂吠 (或狂暴) 的载体, 但左无强力霉素作为阴性对照。注意: 成功的感染可以通过 qRT PCR 方法来验证, 如前所述的1, 它是针对人狂吠转基因的底漆。 经过7天的诱导与强力霉素, 分离黏附细胞通过孵化与0.05% 胰蛋白酶/EDTA (150 ul/井) 10 分钟37°c;停止 trypsinization 稀释1:5 在洗涤介质 #2 (600 ul/井) 和计数细胞。并用重悬细胞在乳腺菌落培养基 (每井1毫升), 补充2微克/毫升强力霉素和种子在克隆密度1000细胞/井在24以及超低的附件板。注意: 在基底膜基质添加时, 要确保乳腺菌落培养基为冰寒。基底膜基质在到达时必须始终保存在-20 摄氏度, 并在一夜之间慢慢解冻4摄氏度;一旦解冻, 它必须总是在冰上处理, 根据制造商的指导方针。 一旦狂吠表达 LD 细胞开始增殖和成长为 MaSC 样的殖民地在悬浮 (yMaSC 殖民地) (播种后14天), 计数和进程进一步分析 (图 1C)。注意: 负控制单元 (如点 1.4.3) 将保持为单个细胞。 在 yMaSC 菌落生长14天内, 每72小时补充新鲜乳房菌落培养基的培养;要做到这一点, 准备一个整除的乳房菌落培养基没有5% 基底膜基质, 补充10x 浓度的补充剂, 并增加1:10 的总体积每井 (例如100 ul 在1毫升的总培养基), 以避免过度稀释矩阵悬浮。 yMaSCs 的亚培养 从乳腺菌落培养基中恢复主要菌落, 然后分离和补种。注: 由狂吠重组的 LD 细胞衍生的 yMaSC 菌落获得自我更新能力, 如果没有进一步的强力霉素管理 (i. e, 独立于转基因吠/狂暴的表达), 可以成功地进行亚培养。 准备, 在细胞培养罩下, 乳腺菌落培养基为阶梯1.4.1 和乳腺 organoid 培养基。 收集每个样品和孵化在多余的体积 (10:1) 冰冷 HBSS 1 小时冰, 以溶解基底膜基质。用离心在 180 x g 5 分钟和并用重悬冰 HBSS 中清洗菌落3x。孵化菌落在0.05% 胰蛋白酶/EDTA 10 分钟37°c, 以获得一个单一的细胞悬浮。用 p1000 尖吸出10x 的吸管, 确保完全离解到单细胞水平。 计数和补种细胞在乳房殖民地媒介 (每井1毫升), 不用强力霉素在克隆密度1000个细胞/井在24和超低的附件板材。每10-14 天重复这个传代程序来评估自我更新。 在第三段之前, 通过 yMaSC 殖民地在 organoid 文化条件, 加强 yMaSC 扩展和允许形成微型腺体, 那自我组织在双层上皮密切地令人想起在体内乳腺组织学组织。 从乳腺菌落培养基中恢复菌落, 如步1.5.3 到1.5.4。并用重悬在100% 生长因子中的菌落减少了基底膜基质, 考虑到在基体的150µL 中, replate 24 井超低附着板的每个井的最大20-25 个菌落。 在37摄氏度的细胞培养孵化器中孵化出40分钟的板块, 然后让基底膜基质凝固, 然后用乳腺 organoid 培养基的 500 ul 对凝胶进行叠加。 几天后, 检查形成的殖民地, 形成萌芽 organoids (图 1E)。 经过10-14 天, 通过或处理 organoids 进行进一步分析。 为了通过 organoids 文化, 通过收集每个样品和孵化在10:1 冰冷 HBSS 1 小时在冰, 为了溶解基底膜基质, 恢复 organoids。用 180 x g organoids 5 分钟, 并用重悬冰 HBSS, 洗净3x。 孵育 organoids 在0.05% 胰蛋白酶/EDTA 10 分钟37°c, 以获得一个单一的细胞悬浮。吸管 organoids 向上和向下10x 与 p1000 提示, 以确保完全离解到单细胞水平。 补种作为单细胞悬浮在一滴100% 生长因子减少基底膜基质 (150 ul 为每井24井超低附着板)。让基底膜基质形成一个凝胶通过孵化40分钟在37°c 在细胞培养孵化器和覆盖凝胶与 500 ul 的乳房 organoid 培养基。注: yMaSC organoids 可通过从100% 基底膜基质培养中恢复为步进 1.5.13, 避免 trypsinization。贮存在乳腺 organoid 培养基中, 辅以10% 亚砜。 快速冷冻 yMaSC organoids-80 摄氏度, 然后保存在液氮中。 2. yDucts 的产生 注意: 2 节的所有媒体和解决方案组合都在表 2中指定。 原发性胰腺腺泡细胞的分离 放置解剖钳和剪刀在70% 乙醇和准备下细胞培养罩腺泡培养培养基, 15 毫升为每只老鼠;腺泡恢复培养基, 每只老鼠60毫升;PBS/PS;库存溶液胶原酶 I;胶原酶 I 溶液 A, 每只老鼠15毫升;中性鼠尾胶原蛋白 i 溶液。中和鼠尾胶原蛋白 i 到 pH 值 = 7, 先用0.1 氮氢氧化钠来调节胶原溶解的醋酸, 再用 10N HCl. 在 PBS/PS 中稀释至2.5 毫克/毫升. 保持鼠尾胶原蛋白 i 和所有的试剂在冰上中和。牺牲6到9周–正常基因型的老鼠。 将每只老鼠放在背上, 用70% 乙醇溶液冲洗腹部。沿腹壁进行纵切口。定位和解剖胰腺 (以脾脏为导向), 并将其放置在10厘米非细胞粘附盘中, 10 毫升冰冷 PBS/PS. 立即将盘子转移到细胞培养罩下。从这个步骤开始, 工作总是在细胞培养罩下。 转移每个胰腺在一个新的非细胞粘附盘以前填充7毫升胶原酶 I 溶液 a。 用一双一次性手术刀快速切碎每个胰腺, 以获得大约1毫米3片段的均匀组织悬浮。注意: 重要的是要注意, 这一过程应采取不超过2分钟的最佳细胞活力。 为胶原酶消化37摄氏度, 5% CO2在细胞培养孵化器中孵育10分钟, 每3分钟晃动, 以保证均匀的组织消化。 恢复50毫升圆锥管 (每一个胰腺) 的消化组织, 用10毫升的腺泡洗涤培养基冲洗盘子, 将其放在同50毫升圆锥管中, 吹打消化组织不超过3x。 在18摄氏度的 100 x g 处旋转消化组织5分钟, 取出上清液。注: 在这个步骤中, 在18摄氏度以下的细胞向下旋转以降低胶原酶活性。 并用重悬7毫升胶原酶 I 溶液中的组织颗粒, 并将此溶液倒入新的10厘米非细胞胶盘中。 孵育第二轮胶原酶消化37°c 为10分钟, 在步骤 2.1.5, 摇晃每3分钟, 以确保均匀组织消化。同时, 为每个胰腺准备一个干净的50毫升圆锥管, 上面有100微米细胞过滤器。 恢复消化组织和通过100微米细胞过滤器通过浸泡的组织与无菌10毫升注射器柱塞 (确保仔细压下组织, 避免剪切力切线到过滤器表面)。用10毫升的腺泡洗涤培养基冲洗盘子, 通过同一100微米细胞过滤器将这10毫升通过。 在18摄氏度的 100 x g 处旋转消化组织5分钟, 取出上清液。 用10毫升腺泡洗涤培养基回收组织颗粒。在50毫升圆锥管中转移细胞溶液, 其中含有额外的10毫升新鲜的腺泡洗涤培养基, 避免过量吹打泥沙的颗粒。 在18摄氏度的 100 x g 处旋转消化组织5分钟, 取出上清液。 仔细并用重悬6毫升腺泡回收培养基中的消化组织, 并将其分布在2口6井多井组织培养板, 每3毫升。在显微镜下, 仔细评估腺泡分离的质量, 它表现为腺泡簇的均匀悬浮, 单个细胞比例较小 (参见图 2B);去除任何大的组织团簇最终呈现 (通常也可见肉眼), 通过吹打他们的解决方案。 原发性胰腺腺泡细胞的播种 在细胞培养孵化器中孵育37摄氏度的消化腺泡簇, 以使细胞恢复。 在细胞恢复大衣48井多井与 100 ul 的中和大鼠尾胶原蛋白 I 和孵化1小时37°c 在细胞培养孵化器, 以允许水凝胶垫形成。 经过2小时的细胞恢复, 收集腺泡细胞悬浮在锥形管, 旋转下来5分钟 100 x g 在18°c, 并删除上清。 并用重悬腺泡细胞在腺泡培养基适当容积 (150 ul 为48井组织培养板材的每个井)。将每个分离的胰腺种子分成16口, 获得最佳密度 (100-120 腺泡簇/井)。 用等量的中和大鼠尾胶原 i 溶液稀释这个腺泡悬浮液, 把管子放在冰上。仔细和快速地混合在2.2.2 描述的胶原垫上的细胞悬浮液 (48 井多井组织培养板每井 300 ul)。 孵育1小时在37°c 在细胞培养孵化器允许水凝胶形成。 胰腺 organoids 的诱导 用 500 ul 腺泡培养培养基覆盖胶原凝胶, 辅以2微克/毫升强力霉素, 用于从 R26-rtTAM2 诱导胰 organoids ;TetO-狂吠S127A 鼠标;负控制是由在相同条件下培养的 R26-rtTAM2 单元提供的, 或者是 。TetO-狂吠S127A 在没有强力霉素的情况下培养的细胞。 腺泡培养培养基中培养的腺泡细胞, 辅以2微克/毫升强力霉素5至7天清爽培养基 (300 ul/井) 每 48 h 和以下 organoid 形成由形态学变化对囊肿形成导管样结构 (图 2C)。一旦 organoids 形成, 细胞可以传代胰腺 organoid 培养条件或收获进一步分析 (例如: RNA 提取, 免疫荧光)。 胰 organoids 的亚培养 为了评估其自我更新能力, 无性通过狂吠诱导胰腺 organoids (yDucts) 在三维基底膜基质水凝胶 (胰腺 organoid 培养条件) 独立的外源吠/狂暴供应 (i. e。, 独立于强力霉素管理)。 制备胰蛋白酶 005%/EDTA;100% 生长因子降低基底膜基质;胰 Organoid 培养基和胶原酶 I. 的溶液 B。 准备一个15毫升圆锥管与4毫升胶原酶 I 溶液 B 为每个井被传代。 摒弃培养基, 小心翼翼地从水井中提取水凝胶, 并将其转移到锥形管上。 孵化管在37°c 30 分钟, 持续剧烈晃动, 允许完全消化胶原基质 (检查每10分钟, 直到水凝胶完全可溶性)。在 750 x g 处向下旋转恢复的细胞2分钟, 并清除上清。 在1毫升的胰蛋白酶 005%/EDTA 中孵育恢复细胞, 在37摄氏度10分钟, 以获得单个细胞悬浮。稀释胰蛋白酶与9毫升 PBS 1x, 旋转下来在 750 x g 为2分钟和去除上清。 并用重悬在冰冷生长因子中的细胞颗粒减少基底膜基质和种子在超低附着板 (通常是一滴 150 ul 在一个井的24井板)。 让基底膜基质水凝胶通过孵化细胞培养孵化器中的板块40分钟在37摄氏度, 然后覆盖与胰腺 Organoid 培养基 (每井 500 ul) 固化。yDucts 将在7-10 天内成长为囊肿样 organoids (图 2D)。 为进一步传代 organoids 可以从地下室膜基质中通过孵化在冰冷的 pbs 1x 30 分钟, 然后洗3次, 在 180 x g 向下旋转5分钟和泥沙在冰冷 pbs 1x, 以避免矩阵的结转。然后将 Organoids 与胰蛋白酶0.05% 分离, 以10分钟的 reseeded 在新鲜基底膜基质中获得单细胞悬浮液, 然后用胰 Organoid 培养基 (如 2.4. 7-2. 4.8) 进行叠加。 yDuct organoids 可在液氮中低温保存, 从100% 基底膜基质培养中恢复为步向 2.4.9, 避免 trypsinization, 并以10% 亚砜为胰 Organoid 培养基。 yDuct organoids 在-80 ºC 迅速冻结, 然后保存在液氮中。