هنا، نحن نقدم وسيلة سهلة الاستخدام، وتنوعاً لإجراء التصوير مباشر للعمليات الإنمائية في morphogenesis العامة ووتر العضلات خاصة في المعيشة الخوادر المورفولوجية .
تمكين العضلات جنبا إلى جنب مع الأوتار وهيكل عظمى الحيوانات بما فيها البشر التحرك على أجزاء الجسم. هو يحافظ morphogenesis العضلات درجة عالية من الحيوانات إلى البشر. ولذلك، يمكن استخدام النظام النموذجي المورفولوجية قوية لدراسة مفاهيم التنمية وتر العضلات التي يمكن تطبيقها أيضا على البيولوجيا البشرية العضلات. هنا، نحن تصف بالتفصيل كيف يمكن بسهولة تصويرها morphogenesis النظام وتر العضلات الكبار في المعيشة، تطوير الخوادر المورفولوجية . ومن ثم، يسمح الأسلوب التحقيق البروتينات والخلايا والأنسجة في بيئتهم الفسيولوجية. بالإضافة إلى بروتوكول خطوة بخطوة مع نصائح مفيدة، نحن نقدم استعراضاً شاملا للمعلمة فلوريسسينتلي ماركر البروتينات التي مناسبة لدراسة النظام وتر العضلات. لتسليط الضوء على تطبيقات متعددة للبروتوكول، نعرض المثال أفلام تتراوح بين التصور الأحداث morphogenetic طويلة الأجل – التي تحدث في مقياس الوقت لساعات وأيام – لتصور عمليات الدينامية قصيرة الأجل مثل ارتعاش العضلات التي تقع في نطاق مرة ثانية. أخذت معا، هذا البروتوكول ينبغي أن تمكن القارئ على تصميم وإجراء تجارب العيش-التصوير للتحقيق morphogenesis وتر العضلات في الكائن الحي سليمة.
جهاز العضلات وتر، يسمح للحيوانات بما فيها البشر التحرك على أجزاء الجسم. الغاية هي حفظت لبنات البناء الجزيئي للنظام وتر العضلات. ولذلك، يمكن دراسة مفاهيم التنمية وتر العضلات ذات الصلة للبيولوجيا البشرية العضلات، على سبيل المثال morphogenesis عضلة ووتر عضلة مرفق ميوفيبريل التنظيم الذاتي، استخدام melanogaster المورفولوجية كالوصول إليها بسهولة النظام النموذجي. ويضم النظام الخوادر المورفولوجية العديد من المزايا التجريبية. أولاً، في مرحلة الخوادر – عندما يتم تشكيل العضلات الكبار – الكائن الحي لاطئة وبالتالي من السهل الصورة في مجهر على مدى فترة الساعات أو حتى أيام. وثانيا، بإغلاق العديد من العضلات النموذج كافية تحت السطح الخوادر ذلك لأنهم يمكن تصويرها داخل الكائن الحي، سليمة وشفافة جزئيا. وثالثاً، يمكن أن يحقق العضلات في بيئتها الطبيعية، حيث يتم توصيلها إلى تشكيل الهيكل الخارجي عبر خلايا الأربطة والأنسجة التوتر هو بناء. هذا غير ممكن في نظم الاستزراع الخلية العضلات. وأخيراً، يتوفر عدد كبير أدوات الجينية في المورفولوجية. ومن بين هذه هي العديد من علامات المعلمة فلوريسسينتلي التي تسمح لتصنيف أنواع الخلايا المحددة أو هياكل سوبسيلولار للتصوير في فيفو.
ويلخص الجدول 1 أهم العلامات المستخدمة لدراسة morphogenesis وتر العضلات. وتتضمن علامات أوفيريكسبريسيد باستخدام GAL4-UAS-النظام1 ومعلم اندوجينوسلي البروتين علامات2،،من34. ميزة النظام GAL4 UAS هو أن العلامات عموما يعبر عن مستويات عالية، أسفر عن إشارة قوية يمكن تصويرها بسهولة في الجامعة-جبل الخوادر. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق خصوصية الأنسجة عن طريق اختيار السائقين GAL4 بعناية. استفادة البروتينات الانصهار أعرب تحت الرقابة الذاتية أن القوى المحركة للبروتينات ذات الصلة يمكن أن تكون درس في فيفو، بينما يمكن استخدامها أيضا كعلامات لأنواع مختلفة من الخلايا أو هياكل سوبسيلولار محددة، على سبيل المثال، ΒPS-إنتغرين-التجارة والنقل لمواقع مرفق العضلات. معا، هذه العلامات توفر مرونة عالية في التصميم التجريبي واختيار بحث المشاكل التي يمكن حلها الآن وفي المستقبل.
الهيكل المسمى | علامة | التعبير والتعريب | الفئة | عدد الأسهم | التعليق | Ref. | ||||||
العضلات | Mef2-GAL4 | جميع ميوبلاستس وجميع العضلات في جميع مراحل | خط GAL4 | BL 27390 | 5 | |||||||
1151-GAL4 | السلائف العضلات الكبار و myotubes المبكر حتى إيتش تو فور ح APF | خط GAL4، فخ محسن | – | 6 | ||||||||
Act79B-GAL4 | القفز العضلات عند المفاضلة | خط GAL4 | – | 7 | ||||||||
Act88F-GAL4 | عضلات الطيران غير المباشرة بدءاً إيتش وان فور ح APF | خط GAL4 | – | 7 | ||||||||
Act88F-Cameleon 3.1 | عضلات الطيران غير المباشرة بدءاً إيتش وان فور ح APF | محسن Act88F/المروج القيادة Cameleon 3.1 | – | Ca2 + مؤشر | 8 | |||||||
Act88F–بروتينات فلورية خضراء | عضلات الطيران غير المباشرة بدءاً إيتش وان فور ح APF | بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط) | fTRG78 و fTRG10028 | 4 | ||||||||
له-nls-بروتينات فلورية خضراء | عضلة الكبار السلائف، النووية، حتى ح إيتش تو فور الإدارة العامة الاتحادية في عضلات الطيران غير المباشر | محسن/المروج مع المراسل nls-بروتينات فلورية خضراء | – | جزء محسن 1.5 كيلو بايت | 9 | |||||||
Mhc-تاو-بروتينات فلورية خضراء | microtubules في قوالب DLM والتفريق بين العضلات | محسن/المروج مع المراسل تاو-بروتينات فلورية خضراء | BL 53739 | 10 | ||||||||
ΒTub60D–بروتينات فلورية خضراء | ميكروتوبوليس في ميوتوبيس (على سبيل المثال في عضلات الطيران غير المباشر من ح إيتش وان فور لوكالة فرانس برس بشدة في التناقص بعد إيتش فور إيت ح الاتحادية) | بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط) | fTRG958 | 4 | ||||||||
Mhc-التجارة والنقل (weeP26) | ساركوميريس (خيط سميك) في جميع عضلات الجسم (على سبيل المثال في عضلات الطيران غير المباشر بدءاً من ح إيتش ثري زيرو الاتحادية) | بروتينات فلورية خضراء-فخ | – | استخدام متخالف، تسميات مجموعة فرعية إيسوفورم | 11 | |||||||
سلس-بروتينات فلورية خضراء | ساركوميريس (القرص Z) في جميع عضلات الجسم (على سبيل المثال في عضلات الطيران غير المباشر بدءاً من ح إيتش ثري زيرو الاتحادية) | بروتينات فلورية خضراء-فخ (صائدة الذباب خط) | – | G53، استخدام متخالف | 2 | |||||||
Zasp66–بروتينات فلورية خضراء | ض-القرص في جميع عضلات الجسم | بروتينات فلورية خضراء-فخ (صائدة الذباب خط) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
Zasp52–بروتينات فلورية خضراء | ض-القرص في جميع عضلات الجسم | بروتينات فلورية خضراء-فخ (صائدة الذباب خط) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
Hts-بروتينات فلورية خضراء | أكتين ملزمة؛ وأعرب في ظهارة، وميوبلاستس وميوتوبيس | بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط) | fTRG585 | 4 | ||||||||
Dlg1–بروتينات فلورية خضراء | تقاطعات الخلايا الظهارية، وميوبلاستس، والأغشية في العضلات في جميع مراحل | بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط) | fTRG502 | 4 | ||||||||
موقع مرفق العضلات | ΒPS-إنتغرين-بروتينات فلورية خضراء | مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر) | بروتينات فلورية خضراء تدق في | – | 13 | |||||||
تالين-التجارة والنقل ومشري | مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر) | بروتينات فلورية خضراء-فخ (تقليد الخط) | – | 3 | ||||||||
تالين-بروتينات فلورية خضراء | مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر) | بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط) | fTRG587 | 4 | ||||||||
أمثاله-بروتينات فلورية خضراء | مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر) | بروتينات فلورية خضراء-فخ (صائدة الذباب خط) | كيوتو 110951 (ZCL3111) | ZCL3111، ZCL3192 | 2 | |||||||
Vinc-التجارة والنقل، وطلب تقديم العروض- | مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر) | بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (التحوير) | – | 13 | ||||||||
وتر | ريال-GAL4 | خلايا وتر الصدر، طوال مرحلة الخوادر | خط GAL4، فخ محسن | BL 26663 | متماثل المميتة | 14 | ||||||
عضلة ووتر | Duf-GAL4 | العضلات وابيثيليا، بداية مبكرة | خط GAL4 | BL 66682 | كيري-rP298، مؤسس علامة خلية | 15 | ||||||
UAS-الصحفيين | UAS-التجارة والنقل–التقييم | ربط أكتين | خط UAS | BL 31776 | أكتين ملزمة المجال من موسين تنصهر للتجارة والنقل | 16 | ||||||
UAS-مشري–التقييم | ربط أكتين | خط UAS | – | Gma تنصهر فيها مشري | 17 | |||||||
UAS- ليفيكت–بروتينات فلورية خضراء | ربط أكتين | خط UAS | BL 35544 | 18 | ||||||||
UAS-ليفيكت-روبي | ربط أكتين | خط UAS | BL 35545 | 18 | ||||||||
UAS-CD8-بروتينات فلورية خضراء | ربط الغشاء | خط UAS | مختلف الأرصدة، مثلاً: BL 32184 | 19 | ||||||||
UAS-CD8-مشري | ربط الغشاء | خط UAS | BL 27391 و 27392 | 20 | ||||||||
UAS-النخيل-متشيري | ربط الغشاء عن طريق بالميتويليشن | خط UAS | BL 34514 | UAS-برينبوو | 21 |
الجدول 1: معلم فلوريسسينتلي علامات البروتين مناسبة لدراسة العضلات وتر morphogenesis في فيفو.
هنا، نحن تصف بالتفصيل كيف يمكن إجراء تصوير morphogenesis وتر العضلات في الخوادر للمعيشة بسهولة ونجاح (الشكل 1). وبدلاً من ذلك، يمكن أن تكون ثابتة الخوادر، تشريح وهي إيمونوستينيد، الذي يسمح باستخدام الأجسام المضادة أيضا تسمية البروتينات التي لا يعيش علامات المتاحة22. في هذه الحالة، نوعية التصوير أعلى بصفة عامة لأن هناك أي تحرك ويمكن وضع الهيكل للاهتمام بالقرب من ساترة. ومع ذلك، تشريح والتثبيت يمكن أن يؤدي إلى أضرار والجزيئية أو يمكن فقط دراسة ديناميات النسيج، على سبيل المثال، العضلات الوخز، في الحي.
البروتوكول قدم وصف كيفية صورة morphogenesis وتر العضلات في المعيشة الخوادر المورفولوجية لاستخدام مجموعة متنوعة من البروتينات المعلمة فلوريسسينتلي. يمكن استخدام هذا في فيفو التصوير استراتيجية لدراسة العمليات الإنمائية في بيئتها الطبيعية للكائن الحي كامل.
من الأهمية بمكان لتجربة ناجحة للعثور على نقطة الوقت التنموية الصحيحة لتحليل. على سبيل المثال، بدء عضلات الطيران غير المباشر دورسولونجيتودينال التمسك بأهدافها وتر في إيتش وان سيكس ح APF23 بينما عضلات البطن وضع في وقت لاحق ونعلق على طرفي فقط بين 30 و 40 ح APF26. ونتيجة لذلك، ينبغي أن تستخدم الكتابات المنشورة سابقا إيجاد نقاط الوقت المناسب للتنمية لتحليل، أو إذا لم تدرس الأنسجة أو هيكل للاهتمام بالتفصيل قبل، التنمية الشاملة وقد تتسم أولاً.
لتصاعد الخوادر بنجاح على شرائح بلاستيكية مبنية خصيصا، من المهم أن الأخاديد أبعادا مناسبة: الأخاديد الحاجة إلى 1.0-1.5 مم على نطاق واسع و 0.3-0.4 ملم العميق. ويسمح هذا العمق ضبط المسافة الدقيقة إلى ساترة العلوي مع فاصل كوفيرسليبس حسب الحاجة. ومع ذلك، ساترة فاصل واحد على الأقل ينبغي أن تستخدمها لتجنب استنزاف والغليسيرول 50% بعيداً عن العينة القوى الشعرية. الموضع الصحيح من الخوادر في groove يتطلب بعض الخبرة، وينبغي أن يكون الأمثل أن هيكل للاهتمام أقرب ما يمكن إلى ساترة.
إذا كان عدد كبير من الخوادر المفترض أن يتم تصويرها في الدورة مجهر واحد، ويمكن جميع مثبتة مسبقاً وثم تخزينها في حاضنة حتى التصوير لضمان التوقيت التنموي السليم. ينبغي الخوادر البقاء على قيد الحياة الإجراء بأكمله وأيضا على الأقل محاولة اكلس إذا أبقى على الشريحة بعد تصوير. يمكن استخدام معدل البقاء على قيد الحياة كقراءات للتحقق ما إذا كانت ظروف التصوير تضر الخوادر.
وينبغي اختيار إعدادات التصوير بعناية وفقا لمتطلبات التجريبية. للأفلام القصيرة الأجل، يحتاج معدل إطارات عال مقابل نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية أن تكون متوازنة، بينما يمكن استخدام طاقة الليزر العالية نسبيا دون الأضرار الخوادر كثيرا. ومع ذلك، للأفلام الطويلة الأجل، قوة الليزر إبقاؤها عند مستوى معتدل وينبغي أن لا تصويرها الخوادر باستمرار بل في بعض النقاط الزمنية، على سبيل المثال، كل 20 دقيقة. للتأكد من أن هيكل المصلحة عدم الخروج من مجال الرؤية، قد يكون من الضروري إعادة ضبط الموضع من z-المكدس بين النقاط الزمنية. على حد علمنا، فتح القضية الخوادر في حد ذاتها لا تؤثر على توقيت التنموية. ومع ذلك، ينبغي استخدام مرحلة التحكم في درجة الحرارة لأفلام طويلة الأجل لضمان التوقيت التنموي السليم. مراعاة هذه الاعتبارات، يمكن الحصول على أفلام الزاخر.
يمكن استخدام البروتوكول المقدم لتصور morphogenesis وتر العضلات ليس فقط ولكن أيضا الأنسجة النامية الأخرى، على سبيل المثال، الجناح ظهارة29. فقط ثلاثة تعديلات على هذا البروتوكول المطلوبة: (1) فتح القضية الخوادر أعلاه الجناح بدلاً من الصدر أو البطن، (2) تحديد المواقع الخوادر مع الجناح نحو ساترة الأعلى، و (3) استخدام علامة نيون مختلف البروتينات. مع النهوض كريسبر/Cas9-التكنولوجيا، البروتينات الفلورية كلمات أكثر وأكثر اندوجينوسلي تكون متاحة، وأنها أصبحت أكثر وضوحاً لاستهداف المكاني الذاتية في المورفولوجية30،31 , 32-في المستقبل، وهذا سيتيح توضيح ديناميات العديدة البروتينات، والخلايا والأنسجة كاملة في بيئتهم الفسيولوجية بالتفصيل.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر مانويلا ويتكونات للحصول على العنوان S3 الفيلم. ونحن ممتنون رينهارد Fässler على الدعم السخي. وأيد هذا العمل قبل التطريز الشباب محقق برنامج ()، “مجلس البحوث الأوروبية” ضمن “البرنامج الإطاري السابع” للاتحاد الأوروبي (FP/2007-2013)/310939 منحة منسق الإغاثة الطارئة ()، و “جمعية ماكس بلانك” (S.B.L.،)، “المركز الوطني” ل البحث العلمي (يزار) ()، مبادرة التميز عميد جامعة إيكس-مرسيليا ()، إبلاغ لابيكس () وفي بورنغير انغلهايم Fonds (S.B.L.).
Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
fly food in bottles (or vials) | – | – | standard culture medium |
paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | – | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |