Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации внутри простаты инъекции клеток рака простаты, с последующее кастрация. Ортотопическая доклинических моделей андроген зависимых и кастрация стойкие рака предстательной железы имеют решающее значение для изучения болезни в контексте микроокружения опухоли клинически значимых и иммунокомпетентных хоста.
Ортотопическая опухоли моделирование является ценным инструментом для исследований доклинических рака предстательной железы, поскольку он имеет несколько преимуществ над оба подкожной и трансгенных генетически модифицированные мыши модели. В отличие от подкожной опухоли ортотопическая опухоли содержат более клинически Точная сосудистую, микроокружения опухоли и ответы на несколько терапии. В отличие от генетически модифицированные мыши модели, ортотопическая модели могут выполняться с более низкой стоимости и в меньше времени, связаны с использованием весьма сложной и неоднородной мыши или человеческих раковых клеток линии, скорее, сингл генетические изменения и эти клетки линии могут быть генетически модифицированных, таким образом, чтобы выразить изображений агентов. Здесь мы представляем протокол к хирургическим путем впрыскивать выражая Люцифераза и mCherry линии клетки мышиных рака простаты в передней доле предстательной железы мышей. Эти опухоли ортотопическая мышей разработаны, которые были неинвазивно наблюдаемого в естественных условиях и дополнительно проанализировать объем опухоли, веса, мыши выживания и иммунных инфильтрации. Кроме того ортотопическая опухоль подшипник мышей были хирургически кастрирован, приводит к регрессии опухоли немедленное и последующего рецидива, представляющие кастрация стойкие рака простаты. Хотя технических навыков, необходимых для выполнения этой процедуры, эта модель сингенных ортотопическая андроген зависимых и кастрация стойкие рака простаты является весьма полезным для всех следователей в области.
Рак простаты оценивается имеют наиболее высокие показатели заболеваемости (161,360 человек) и вызывает гибель третьего большинство мужчин рак (84,590 человек) в 2017 году1. После диагностики опухоли простаты андроген зависимых и лечатся хирургическим простатэктомии, лучевой терапии и/или лишение терапии андрогена (ADT), но каждый лечение связано с несколько основных заболеваний и осложнений2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Несмотря на регрессии опухоли после ADT, почти все опухоли повторения как кастрация стойкие рака простаты (УПК). На данном этапе утвержденные терапии включают доцетаксел, иммунотерапия Sipuleucel-T и анти андрогенов малых молекул enzalutamide и abiraterone, но не индивидуальная терапия дает преимущество выживания больше чем 5,2 месяцев11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. Таким образом, мужчины на всех стадиях рака простаты необходимо улучшение лечения и управления заболеваемости, для которых оптимальным доклинические заболевание моделирование имеет решающее значение.
С правильной процедуры линии клеток рака простаты может прививаться хирургическим путем в мышиных простаты, приводя к развитию опухолей как сингенных или культивированная ортотопическая. Ортотопическая опухоль моделирование идеально подходит для всех опухоли биологии и наркотиками развития исследований, позволяя развития опухоли с клинически представитель опухоли микроокружения (ТМЕ). Предыдущие исследования продемонстрировали, что подкожной опухоли (с.к.) у измененных опухолевых сосудистую, ведущих к дифференциальной и менее клинически точные ответы на анти ангиогенных терапии18,19. Кроме того несколько исследований отметил, что увеличение или снижение эффективности нескольких химиотерапии в лечении той же линии клеток, в зависимости от того, было ли управление s.c. или orthotopically, последний из которых лучше всего представлена, что видно в человека Рак в20,21,22. Кроме того только в ортотопическая модели рака толстой кишки, но не в модели s.c., опухоли производят правильный деструктивные ферментов, необходимых побудить метастазов23. Наконец как immunotherapies продолжают появляться на переднем крае терапии рака, и особенно они еще предстоит обеспечить значительные выгоды для рака простаты24,25, сингенных доклинических моделей с точной TME и слива лимфатические узлы в иммунокомпетентных хосты имеют решающее значение.
Есть много факторов, ответственных за эти несовместимые выводов, основанных на опухоли. С другой TME раковые клетки подвергаются воздействию различных тканей конкретных эндотелия и изменены ангиогенеза, влияя тем самым на опухоль развития26,27. Ортотопическая опухоли с правильным TME позволяют клинически значимых лекарств, гипоксических условий и оценке анти ангиогенных терапии28. Хотя генетически модели (ГСМОС) содержат точные TME, они требуют давно раз для разведения, высокой стоимости и часто основаны на манипуляции одного или нескольких генов выбил или оверэкспрессировали за пределами клинически значимых уровней. В отличие от человека или мышиных простаты рак клеточных линий, используемых в ортотопическая опухоли, как человека опухоли, генетически гораздо более сложны, как в пределах одной клетки, так и в отображении гетерогенность между клетки29,30. Также в отличие от драгоценных камней, ортотопическая рак клеточных линий может быть спроектирован, чтобы выразить визуализации формы или увеличение или снижение уровня других молекул интерес и in vitro и in vivo экспериментальные результаты могут сравниваться непосредственно. Ортотопическая опухоли также может быть сформирован из первичных клеток пациента производные. Здесь мы приводим методологии для выполнения внутри простаты инъекции клеток рака простаты, которые формируют ортотопическая андроген зависимых опухолей и, после кастрации, повторяются как ортотопическая УПК.
В этой рукописи мы наметим протокол для выполнения инъекции хирургические интра простаты рак клеток. Мы использовали андроген зависимых и MYC –экспрессирующих (MYC гиперэкспрессия рассматривается до 80-90% человеческого рака простаты39) мышиных рака простаты линия клетки, Myc-CaP, первоначально изолирован от Hi-Myc мыши32 ,33. Эта линия клетки было стабильно преобразованы выразить Люцифераза и mCherry, для неинвазивной в vivo биолюминесцентных и флуоресцентные опухоли изображений, соответственно. Кроме того, хирургическая кастрация была исполнена после развития андроген зависимых опухолей, приводит к регрессии опухоли и последующего повторения. Таким образом мы предоставляем детали для моделирования ортотопическая андроген зависимых рака простаты и УПК в иммунокомпетентных хоста.
Myc-CaP клеток вводили в передней доле предстательной железы мышей. Мышь простаты состоит из передней, брюшной и Дорсолатеральное простаты долей, и человека простаты состоит из центральной зоны в пределах одного лепестка40периферийная зона и переходной зоны. В то время как предыдущие исследования анатомически и гистологически сравнили мочку Дорсолатеральное мыши для человека периферической зоне, на сайте большинство рака простаты41и доле передней мыши для человека центральной зоны42, 43, более недавние и всесторонний анализ показал, что передней доли и Дорсолатеральное доли отображать шаблоны выражений тесно связанных генов, по сравнению с брюшной мочку. 44 далее, в передней доле камней40наблюдается развитие рака простаты, и, для внутри простаты процедуры, передней доле позволяет для инъекций необходимый объем раствора раковых клеток с минимальной утечки и изменчивости.
С помощью s.c. и трансгенных GEM рака модели имеют несколько недостатков и ограничений. S.c. опухоли, выращенных в искусственных TME имеют дифференциального ответы к химиотерапии, в отличие от обоих ортотопическая опухоли же клеточных линий и болезней человека20,21,22. Это может быть из-за измененных сосудистую s.c. опухоли, что подтверждается их дифференцированный ответ на анти ангиогенных терапии18,19. Напротив ортотопическая опухоли развиваться с надлежащей TME, слива лимфатические узлы и сосудистую и может быть выполнена с мышиных клеточных линий, тем самым позволяя для анализа иммунологии опухоли и ответ immunotherapies.
Трансгенные камни развиваться опухоли с надлежащей TME в иммунокомпетентных узла, но эти модели обычно упрощать человеческого рака путем развития опухоли с одного или нескольких генетические изменения29. Анализ Myc-CaP и других линий клеток рака простаты, показал, что они содержат гораздо более соматических копии номер изменения и хромосомные изменения, чем опухоли от Hi-Myc мышей и других драгоценных камней, из которых они были производных29. Кроме того камни ограничены повышает стоимость и время, необходимое для мышей, разводить для выполнения экспериментов достаточной мощности. Ортотопическая опухоль моделирования можно преодолеть эти ограничения. Линии клетки человека и мышиных рака простаты содержат многие генетические изменения, отношение к болезни человека29и, как человека рак, также показывают большой гетерогенность между отдельными ячейками30. Ортотопическая мышиных сингенных опухоли позволяют иммунологические анализы, а ортотопическая человека культивированная опухоли позволяют для анализа терапии на клетки человека. Наконец в отличие от с драгоценными камнями, ячеек, строк может быть изменено до инъекции, позволяя для выражения биолюминесцентных или флуоресцентных изображений молекул для мониторинга роста опухоли, нормализовать опухоли бремени среди экспериментальных групп, контролировать ответ на лечение и Следуйте регрессии опухоли и ЦЗПП рецидивов после хирургической кастрации.
Важные шаги в этом протоколе включают обнаружение и экстернализации прилагаемый передней доле предстательной железы и семенных пузырьков без повреждения других тканей или прокола семенных пузырьков, выполняя успешным интра простаты инъекций 30 мкл ячейки подвески без утечки и надлежащим образом собирать любые утечки для предотвращения развития опухоли не ортотопическая во всем животе. Основные ограничения внутри простаты инъекции является достижение технических навыков, необходимых для сведения к минимуму опухоль изменчивость между мышей. Это особенно важно для моделирования КПНИ, которая была добавлена переменная хирургической кастрации. Интра prostatically вводят и кастрированный мышей должны также быть внимательно следил за для восстановления и неблагоприятных событий, как они прошли два крупных выживания хирургических операций. Еще одним ограничением является время каждого внутри простаты инъекции. Это может быть уменьшена для как низкого как 20 мин и хирург помощник может подготовить следующий мыши как текущий мыши зашивается. Наконец ортотопическая Myc-CaP опухоли являются агрессивными, быстро растущих опухолей, которые достигают конечной выживание приблизительно 46 дней (и еще в 35 дней) из-за первичной опухоли массы. Исследования, требующие медленнее развития опухоли или долгосрочного лечения должны быть оптимизированы эпирически для первоначального инъекции клеток граф и лечения режима. В отличие от ограничений s.c. опухоли и драгоценные камни все выше ограничения модели ортотопическая опухоли могут быть преодолены, и дополнительные изменения протокола может производиться на основании экспериментальных индивидуальных потребностей.
Как ортотопическая опухоли модель предполагает использование в vitro-обработанные клетки, эти клетки могут быть изменены в зависимости от потребностей исследования. Здесь мы изменили эти клетки выразить стабильно Люцифераза и mCherry мониторинга в vivo опухоли. Мы также выступали ТРИФОСФАТЫ-Cas9 нокаут супрессора опухолевого роста PTEN, для создания более агрессивным, клинически значимых клеточная линия, которая растет быстрее, как ортотопическая опухоли (рукопись в обзоре). С преимущества модели ортотопическая опухоли, возможность изучить как андроген зависимых рака простаты и КПНИ, так и потенциал, чтобы выразить визуализации формы или выберите генов нокдаун или overexpress, этот протокол служит в качестве ценного ресурса для всех исследования рака простаты.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грантов Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Сарки Абдулкадир (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI Р50 CA180995), и Джонатан Anker (NCI F30 CA203472).
Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
RPMI | Gibco | 18875-093 | |
FBS | Gibco | 10437-028 | |
Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |