اليكتروتشيميلومينيسسينسي فحوصات للأجسام المضادة البشرية من جزيرة ليلى
概要
هنا، وقد عرضنا أساليب للكشف عن الأجسام المضادة البشرية جزيرة ليلى باستخدام فحوصات اليكتروتشيميلومينيسسينسي (القامة). يمكن توسيع البروتوكول، المستخدمة للتنبؤ بمرض السكري من النوع 1، عند الكشف عن الأجسام المضادة لأمراض المناعة الذاتية الأخرى.
Abstract
إبراز جزيرة الأجسام المضادة المرتبطة بداء السكري من النوع 1 (T1D) يقود الطريق إلى المشروع وردع هذا المرض في عموم السكان. مقايسة مسافنة رواية مقايسة مرحلة السوائل نونراديواكتيفي للأجسام المضادة جزيرة ليلى مع ارتفاع حساسية وخصوصية من الحالية ‘الذهب’ القياسية الملزمة راديو المقايسة (المكتب الإقليمي لأفريقيا). مسافنة فحوصات أكثر دقة تحديد بداية T1D بريسيمبتوماتيك بالتمييز بين الأجسام المضادة عالية الخطورة، وتقارب عالية من الأجسام المضادة منخفضة المخاطر، والنسب المنخفضة التي تم إنشاؤها في المكتب، وفحوصات الممتز التقليدية المرتبطة بالانزيم (إليزا ). هو المسمى مستضد البروتين المستخدمة في هذا التحليل القامة مع سالفو، العلامة والبيوتين، على التوالي. كل فحص الأجسام مسافنة يستخدم بروتين مستضد معين يحتاج خطوة تحسين قبل أن يمكن استخدامه للتطبيقات المختبرية. هذه الخطوة حيوية لا سيما في تحديد المتطلبات لعلاج حمض المصل وتركيزات نسب المستضدات المختلفة اثنين يحمل سالفو، العلامة والبيوتين. للقيام التحليل، التقاط المصل عينات مختلطة مع سالفو-العلامة-مترافق وبيوتينيلاتيد البروتين مستضد في حل الفوسفات مخزنة (PBS)، الذي يحتوي على 5% ألبومين المصل البقري (BSA). وبعد ذلك، المحتضنة العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في نفس اليوم، أعد مع المخزن المؤقت لمانع صفيحة streptavidin المغلفة والمحتضنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. اليوم الثاني، تغسل لوحة ستريبتافيدين ونقل الخليط مصل مستضد على اللوحة. وضع اللوحة على شاكر لوحة وحدده بسرعة منخفضة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1. وفي وقت لاحق، اللوحة يتم غسلها مرة أخرى، ويتم إضافة المخزن المؤقت للقارئ. ثم تحسب على الجهاز القارئ لوحة اللوحة. يتم نقل النتائج من خلال مؤشر، والذي يتم إنشاؤه من عينات مصلية الداخلية التحكم القياسية الإيجابية والسلبية.
Introduction
تم إنشاء نظام تصنيف مرحلي الأخيرة للمساعدة في تشخيص المراحل الأولية من T1D في المرضى. الكشف الدقيق للأجسام المضادة جزيرة البشرية تلعب دوراً هاما في تحديد والتدريج بريسيمبتوماتيك داء السكري نوع 1، كما يشير إلى وجود الأجسام المضادة جزيرة وجود المناعة الذاتية خلايا بيتا. المعدل في مرض السكري الذي يؤثر على المرضى من حدوث المناعة الذاتية β-الخلية الأولى لأعراض مرض، المرتبطة بعدد ونوع من الأجسام المضادة جزيرة ليلى، هو متغير2،3.
سن الدراسة الأجسام وعيار وتقارب من جزيرة ليلى الأجسام المضادة يمكن أن تؤثر على معدل الانتقال إلى أعراض النوع 1 السكري4،5،،من67،8 ،،من910. مؤخرا، نمواً مسافنة فحوصات قد صودق على نطاق واسع، قد أظهرت زيادة الحساسية، وهي أكثر خاصة بالمرض10،11،،من1213. تعزيز هذه الاختبارات في التنبؤ والتدريج من خطر مرض السكري من خلال سابق كشف الأجسام المضادة في جزيرة ليلى. أنها أدق علامة البدء في جزيرة ليلى المناعة الذاتية وتجاهل إشارات تقارب منخفضة ومنخفضة المخاطر غير ذات صلة بمرض السكري.
في مقايسة القامة، الأجسام المضادة في المصل، إذا كانت موجودة، سد مستضد سالفو-العلامة-مترافق للمستضد القبض على بيوتينيلاتيد في مرحلة السائل. بعد سد، اشتعلت في المرحلة الصلبة رابط البيوتين والكشف عنها من خلال القامة بواسطة سالفو علامة على لوحة streptavidin المغلفة (الشكل 1).
وتستخدم أساسا في هذا الاستعراض، فحوصات يصدرون جسم واحد مع الأجسام المضادة البشرية من جزيرة ليلى. بإيجاز، متعدد جسم ستناقش فحوصات استناداً إلى فحوصات مسافنة واحد. يمكن استخدام التحليل متعدد لتحديد متعددة، ما يصل إلى 10، الأجسام المضادة داخل واحد أيضا، باستخدام 15 ميليلتر من المصل. يمكن استخدام هذا التحليل إنتاجية عالية بسيطة الشاشة، في نفس الوقت، متعددة الأجسام المضادة لأمراض المناعة الذاتية ذات الصلة متعددة بين عامة السكان.
Protocol
Representative Results
Discussion
جزيرة ليلى الأجسام المضادة حاليا المؤشرات الحيوية الأكثر موثوقية للمناعة الذاتية لداء السكري من النوع 1. وضع علامة على بداية جزيرة محددة المناعة الذاتية، وتحديد مخاطر المرض العلني. تم التحقق من مقايسة القامة، لجزيرة ليلى الأجسام المضادة، على نطاق واسع في عدة وطنية ودولية نوع 1 مرض السكري التجارب السريرية. المقايسة أظهرت زيادة الحساسية والدقة مقارنة بالحالية ‘الذهب’ المكتب القياسية. أظهرت المقايسة مسافنة ميزته متفوقة لخصوصية المرض أعلى النسب العالية تميز والأجسام المضادة جزيرة شديدة الخطورة من إشارات منخفضة المخاطر، والنسب المنخفضة التي تم إنشاؤها بواسطة المكتب الإقليمي لأفريقيا. هذا هو لاحظت خاصة في المواضيع هم فقط من جزيرة واحدة الأجسام الإيجابية، وحققت تقدما ابدأ داء السكري نوع 1. معظم هذه النسب المنخفضة الأجسام المضادة وجد أنها فقدت أثناء متابعة اختبار القيام به في غضون أشهر إلى سنة، يتصرف بوصفه ‘عابرة إيجابية.’ كما سبق أن الافتراض، هذه النسب منخفضة ‘واحد’ الأجسام المضادة قد نتجت عن التحصين مع جزيء تحسن. بينما تقارب أعلى، نتيجة ارتفاع الأجسام المضادة جزيرة المخاطر التحصين مع المستضدات جزيرة ليلى نفسها. وباﻹضافة إلى ذلك، فحوصات الممنوعين قد أثبتت قدرتها على تسبق وقت ‘السيرولوجي’ من فحوصات ملزمة الإذاعة القياسية الحالية (المكتب الإقليمي لأفريقيا) قبل سنوات في الأطفال مع ما قبل السكري، الذين قد اتبعت لمرض السكري السريري من الولادة. التجارب سريرية دولية جارية، “المحددات البيئية السكري” في الشباب (تيدي)، يعتمد على كشف دقيق لتحديد توقيت وظهور الأجسام جزيرة الأولى ‘السيرولوجي’ وضع علامة على البداية من جزيرة ليلى المناعة الذاتية وتحديد المشغلات البيئية. سبب المحتمل لزيادة الحساسية في مقايسة القامة أن يلتقط الفحص جميع فئات الغلوبولين المناعي: IgG، IgM، إيغا، أو فريق الخبراء الحكومي الدولي، بدلاً من التقليدية المكتب الإقليمي لأفريقيا أو أليسا التي تعتمد فقط على الكشف عن مفتش.
يبدو الربط من الأجسام المضادة للمستضد في فحوصات القامة، لبعض الأجسام المضادة خاصة مثل الأكاديمية، تكون أعاقت ببعض المكونات الموجودة في مصل الدم البشري الطبيعي. لإزالة أو تحرير هذا التثبيط، كانت معاملة حمض عينات المصل اللازم القيام به قبل المصل كان المحتضنة مع مستضد. كما هو موضح فيالشكل 5]، الأكاديمية مسافنة المقايسة، تعززت إلى حد كبير أنشطة ربط الماوس الأنسولين [مونوكلونل] جسم والأجسام المضادة في مصل المرضى مع antigen. عادة يتم تطبيق التحمض عينات المصل، استخدامها في فحوصات الأجسام المضادة، أن تنأى بالمجمعات منضم موجود مسبقاً. الآلية وراء كيف أعاقت في عينات مصل الدم البشري إشارات الأكاديمية وصدر عن التحميض للمصل غير معروف، ولكن قد استخدمت هذا الأسلوب في غيرها يصدرون على أساس فحوصات14،15.
وفي بعض الحالات، عندما وصف الجزيئات، البيوتين أو سالفو، العلامة، بوسيتيونسينسيدي وضع العلامات من جزيئات البروتين مستضد في، أو قريبة جداً من الرئيسية [ابيتوبس] جسم الملزمة، التي قد تتداخل مع نشاط ملزم للأجسام المضادة. وهذا سوف يقلل من حساسية الفحص ويمكن هدم تماما في التحليل. لوصف الإجراءات الروتينية، تعظيم أو التشبع هو المطلوب لكل جزيء البروتين مستضد لتوليد النشاط الحد الأقصى أو إشارة كل جزيء المسمى بتعظيم قدرات وضع العلامات لكل موقف ممكن وضع العلامات. العلامات غير المشبعة يجب تنفيذها من خلال تخفيض نسبة المولى لوصف جزيئات (البيوتين وسالفو، العلامة) للبروتين مستضد إذا وضع العلامات على antigen يصبح سببا ممكناً لانقطاع النشاط ملزمة جسم. [ابيتوبس] الرئيسية يمكن أن تكون أفضل المحجوزة وتوقف النشاط ملزمة جسم يمكن الإفراج عن استخدام استراتيجية التوسيم غير المشبعة في معظم الحالات.
ينبغي أن تتضمن كل مقايسة قياسية عالية الإيجابية والسلبية رقابة داخلية لحساب الرقم القياسي لعينات غير معروفة. عنصر تحكم إيجابية منخفضة قرب الحد الأعلى للمقايسة للضوابط العادية من المهم أن تشمل رصد حساسية المقايسة. ينبغي أن يبقى المختبر مختبرين ما يكفي من عناصر التحكم القياسية الإيجابية والسلبية للاستخدام على المدى الطويل وينبغي تخزين جميع مختبرين في-20 درجة مئوية. لفحص الجودة، يجب أن يتم تشغيل الاختبارات في التكرارات لكل عينة وكل نتيجة إيجابية ينبغي التأكد منه بتكرار النموذج في مقايسة منفصلة. مقايسة ثالثة ضروري عند المقايسة توكيدي الثاني لا يتفق مع الفحص الأولى ونتائج فحوصات اثنين، الذي يوافق (على سبيل المثال.، +، + أو-،-)، سوف يتم التحديد النهائي لنتيجة إيجابية أو سلبية.
لتعيين لواحدة مسافنة فحوصات منهاج العمل، يمكن توسيعها مقايسة متعدد عند من هذه. في نفس الوقت فإنه يمكن تحديد الأجسام المضادة مختلفة تصل إلى 10 في بئر واحدة واحدة مع كمية صغيرة من المصل. الأجسام المضادة جزيرة الأربعة بما في ذلك الأكاديمية، غادة وألف-2 أ ZnT8A حاليا مساوية في الأهمية للتنبؤ بالمخاطر للتقدم إلى T1D في كلا أقارب مرضى T1D والسكان بصفة عامة. الأساليب المستخدمة لفحص هذه الأجسام المضادة 4 باستخدام قياسات الأجسام واحد الحالية شاقة وغير كفؤة، خاصة بالنسبة لفحص السكان الواسعة النطاق. الأهم من ذلك، يصل إلى 40 في المائة من المرضى الذين يعانون من T1D لها شرط الذاتية إضافية16،17،18. ولسوء الحظ، هناك لا توجد أداة سهلة وغير مكلفة للشاشة لهذه الشروط. والرزن مسافنة متعدد ليس فقط قادرة على الجمع بين 4 فحوصات الأجسام الجزيرة الرئيسية الحالية في أحد، ولكن هي أيضا قادرة على مواصلة الجمع بين فحوصات الأجسام أكثر من أمراض المناعة الذاتية الأخرى ذات الصلة. وهذا يجعل من الممكن القيام بكفاءة عالية الإنتاجية الكشف عن أمراض المناعة الذاتية متعددة في وقت واحد في السكان الواسعة النطاق. في مقايسة مسافنة متعدد، كما هو موضح فيالشكل 6]، كل مجمع جسم مضاد-مستضد شكلت في السوائل-المرحلة سيتم ضبط النفس إلى بقعة محددة رابط مصدر في نفس جيدا. استقبال الإشارات على جهاز قارئ لوحة غير قادرة على التعرف على الإشارات الواردة من مصادر مختلفة 10 من البقع. بيد أن البقع مع إشارة عالية للغاية يمكن توليد خلفية مقايسة عالية وتتسبب في حدوث تداخل للبقع المجاورة عن طريق عبر الحديث. ولهذا السبب، ينبغي أن تكون إشارات الحد الأعلى لكل فحص الأجسام محدودة من 20,000 أقل من التهم الموجهة إليه. في تجربتنا، ينبغي أن توضع الأجسام المضادة مع الخلفيات أقل بعيداً نسبيا من تلك البقع بعد التهم أعلى عند تصميم خريطة موضعية. لدراسات طويلة الأمد باستخدام فحوصات مسافنة متعدد، من المستحسن أن تستخدم رابط نفس للمقايسة الأجسام نفسها للحفاظ على تناسق في التحليل.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة منح DK32083، 2-SRA-2015-51-Q-R منحة JDRF.
Materials
| Human recombinant proinsulin protein(PINS) | AmideBio | Human Proinsulin, Rec | |
| Human recombinant GAD65 protein | Diamyd | rhGAD65 | |
| Human recombinant IA-2 protein | Creative BioMart | IA2 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA-ALORICH | A7906-500G | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| Streptavidin coated plate | MSD | L15SA | |
| Zeba sizing spin column | Thermo Fisher Scientific | 89890 | |
| Twen-20 | Fisher | BP337-500 | |
| HCl | Fisher | A144-500 | |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
| EZ-Link Biotin | Thermo Fisher Scientific | PI21329 | |
| Sulfo-tag | MSD | R91AO-1 | |
| Blocker A | MSD | R93AA-1 | |
| 4x Read Buffer T with Surfactant | MSD | R92TC-1 | |
| EZ-Link NHS-PEG4-Biotin | ThermoScience | 21329 | |
| Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
| 96-well polymerase chain reaction (PCR) plate | Fisher brand | 14230232 | |
| 96-Well Streptavidin plate | MSD GOLD | L 15SA-1 | |
| Zeba Spin Desalting Column | ThermoScience | PL208984 | |
| 96-well Plate Shaker | Perkin Elmer | 1296-003 | |
| Plate Reader | MSD | QuickPlex SQ120 | |
| Benchtop centrifuge with bucket rotary | Beckman | Allegra X-15R |
参考文献
- Insel, A. I., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. . Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. . Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Steck, A. K., et al. TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY). Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).
- Krischer, J. P., et al. TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study. Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).
- Achenbach, P., et al. Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics. Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).
- Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. . Natural history of type 1 diabetes. Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).
- Steck, A. K., et al. Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young. Diabetes Care. 34 (6), 1397-1399 (2011).
- Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).
- Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. . Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
- Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. . Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
- Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
- Yu, L. . Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).
- Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. . Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients. J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).
- Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays. J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).
- Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
- Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
- de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. . Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).
