概要

Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Published: January 25, 2018
doi:

概要

Hipofunción de la glándula salival es una consecuencia frecuente de la terapia de radiación y enfermedad autoinmune. Evaluación reproducible de la función de la glándula salival en modelos de ratón de estas enfermedades es un desafío técnico. Aquí, se describe un método simple de medida preciso y reproducible de la producción de saliva de ratones.

Abstract

Pacientes con síndrome de Sjögren, una enfermedad autoinmune que afecta las glándulas exocrinas, desarrollan inflamación de la glándula salival y han reducido la producción de saliva. Del mismo modo, la producción de saliva está comprometida seriamente en pacientes que reciben radioterapia para cánceres de cabeza y cuello. Modelos de roedores, desarrollados para imitar estas condiciones clínicas, facilitan la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y permitan el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Por lo tanto, la capacidad precisa, reproducible y varias ocasiones medir la función de la glándula salival en modelos animales es fundamental. Basándose en procedimientos previamente descritos en la literatura, que cumple estos criterios y se utilizó para evaluar la función de la glándula salival en ratones se desarrolló un método. Una ventaja adicional de este nuevo método es que se domina fácilmente y tiene poca variación inter-operador. Función de la glándula salival se evalúa como la cantidad (peso o volumen) o (mL/min) de la saliva producida en respuesta a la estimulación de la pilocarpina. La recogida de la saliva es una buena fuente para el análisis de contenido de proteína, las concentraciones de inmunoglobulinas y otras biomoléculas.

Introduction

Las glándulas salivales producen la saliva en respuesta a una variedad de estímulos neurológicos y mecánicos1. Los estímulos son llevados a través del sistema nervioso simpático y parasimpático a los receptores adrenérgicos y colinérgicos en la glándula. La pilocarpina es un agente colinérgico, párr simpaticomimético que actúa predominantemente sobre los receptores muscarínicos. En las glándulas salivales, induce la producción de saliva actuando sobre el receptor muscarínico M31. La producción de saliva tras la administración de pilocarpina es un indicador de la capacidad de responder a la estimulación de las glándulas salivales y es comúnmente usada como una medida de la función de la glándula salival.

Medición precisa de la producción de saliva es importante en el estudio de enfermedades de las glándulas salivales como síndrome de Sjögren2 y lesión por radiación después de tratamiento de cáncer de cabeza y cuello3. Varios métodos se han desarrollado para medir la producción de saliva de roedores. Estos incluyen directa canulación del conducto excretor salival4, colección de saliva desde la cavidad bucal bajo vacío5y colección mediante tubos capilares de cristal6 o una micropipeta7,8, 9. dirigir la canulación del conducto salival proporciona la más precisa y pura saliva. Sin embargo, este es un procedimiento técnicamente difícil, y el potencial para causar lesión ductal excluye colecciones repetitivas saliva del mismo animal. Recogida de saliva bajo vacío puede llevar a resultados variables debido a la sequedad de la saliva del tubo. Esta pérdida es aún más exagerada en ratones con disminución de la salivación. Capillares de vidrio permiten la recogida de saliva para análisis posteriores, sin embargo, cambios en la viscosidad de la saliva secretada en el estado enfermo impide eficiente llenado del tubo capilar. Además, intenta barrer la cavidad bucal para recoger saliva residual puede provocar lesiones. El método de pipeta permite la colección completa, y para el mismo operador, es notablemente consistente entre experimentos. Sin embargo, por razones desconocidas, este método muestra una variación significativa entre los diferentes operadores. Por lo tanto, para permitir comparaciones apropiadas, resulta imprescindible que el operador mismo realiza todos los experimentos relacionados con un proyecto específico. Claramente, esto representa una gran desventaja para un laboratorio.

Para superar estos problemas, se desarrolló un procedimiento que combina métodos de recolección de saliva se utilizan para los seres humanos y roedores. El método del hisopo, que se describe a continuación para medir el volumen de saliva inducida por la pilocarpina es simple, reproducible, no influenciado por el operador y puede realizarse varias veces en el mismo animal. Además, permite recoger la saliva para el posterior análisis de las proteínas, inmunoglobulinas o de otras biomoléculas.

Protocol

El protocolo que se describe a continuación fue aprobado por el cuidado institucional de Animal y uso y sigue las normas éticas establecidas por los institutos nacionales de salud. Todos los datos presentados en este informe se generaron mediante el uso de ratones femeninos que fueron 10-12 semanas de edad. Se utilizaron las siguientes cepas de ratones: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S y F1 (B6XA/J). Todos los ratones fueron alojados en jaulas de barrera (a 5 animales por jaula) en condiciones libres de patógenos específi…

Representative Results

En los sistemas de modelo experimental de ratón, la capacidad de producir saliva en respuesta a la estimulación de la pilocarpina se utiliza como un indicador de la función de la glándula salival. La producción de saliva se midió en ratones hembra de 11 semanas de edad C57BL/6 por el método de esponja. En la figura 1A, los resultados se expresan como la cantidad de saliva (mg) recogido después de cada vez mayor dosis de pilocarpina. A la dosis de 1 mg…

Discussion

La producción de saliva es un proceso complejo y está influenciada por muchos factores. Por lo tanto, la función de la glándula salival en animales de laboratorio de medición puede ser un desafío. Un desafío adicional es que mediciones repetidas de la función de la glándula salival en el mismo animal son necesarias para establecer el inicio de la enfermedad o para demostrar la recuperación después del tratamiento.

El método de hisopo que se describe en este informe es técnicamente…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El estudio fue apoyado por una subvención de los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional de Dental e investigación craneofacial (DE025030).

Materials

Chemicals for saliva collection
Pilocarpine hydrochloride Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA B21410 Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC
Name Company Catalog Number コメント
Anesthesia Mix solution Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.
Zetamine (Ketamine hydrochloride) Vet One, Boise, Idaho, USA C3N VT1 Stock is 100 mg/mL
Anased (Xylazine) Med-Vet International, Mettawa, IL, USA RXANASED-20 Stock is 20 mg/mL
Isotonic sterile saline Vet One, Boise, Idaho, USA 501032 Used as diluent
Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) Henry Schien, Dublin, OH, USA 48272 Used to prevent eyes from drying during the procedure
Name Company Catalog Number コメント
Materials for saliva collection
SalivaBio Children's swab Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA N/A Individually wrapped swabs
50 mL polypropylene tubes VWR, Radnor, PA, USA 89004-364 Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.
Microcentrifuge tubes 0.6 mL VWR, Radnor, PA, USA 87003-290 Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles
Microcentrifuge tubes 2 mL VWR, Radnor, PA, USA 87003-298
Insulin Syringes with permanently attached needles Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 324702
18 gauge regular bevel needles Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 305195
Sterile scalpel blade #11 Integra York Inc PA, USA 4-311
Microdissecting forceps Roboz, Gaithersburg, MD, USA RS-5139 Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length
Label tape Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA sc-224487
3 channel timer Amazon.com, Seattle, WA, USA B06W2KCYVN
Analytical Balance Mettler Toledo, Columbus OH, USA
Name Company Catalog Number コメント
Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction
LPS Invivogen, San Deigo, CA, USA tlrl-b5lps Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip
Imject Alum adjuvant Thermo Scientific 77161 Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse
Rabbit anti-Ro52 antiserum Generated in lab Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52
Name Company Catalog Number コメント
Chemicals/ Kits for saliva analyses
Salivary lysozyme estimation
EnzChek Lysozyme Assay Kit Molecular Probes, Eugene, OR, USA E-22013 Used as per manufacturer's instructions
Name Company Catalog Number コメント
Salivary IgA estimation by sandwich ELISA
Mouse IgA Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 0106-01 Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL
Goat anti- mouse IgA unlabeled Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 1040-01 Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer
Goat anti- mouse IgA HRP Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 1040-05 Detection antibody used at 1:4000 dilution
TMB substrate Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 555214 Used as per manufacturer's instructions
Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates Thermo Scientific, Rochester, NY, USA 3855
Name Company Catalog Number コメント
Salivary protein estimation
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate BioRad, Hercules, CA, USA 5000006 For protein estimation as per manufacturer's instructions

参考文献

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記事を引用
Bagavant, H., Trzeciak, M., Papinska, J., Biswas, I., Dunkleberger, M. L., Sosnowska, A., Deshmukh, U. S. A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice. J. Vis. Exp. (131), e57203, doi:10.3791/57203 (2018).

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