概要

Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

Published: January 25, 2018
doi:

概要

Ipofunzione della ghiandola salivaria è una frequente conseguenza di autoimmune malattia e radioterapia. Riproducibile valutazione della funzione della ghiandola salivaria in modelli murini di queste malattie è una sfida tecnica. Qui, è descritto un metodo semplice per la misurazione accurata e riproducibile della produzione di saliva nei topi.

Abstract

I pazienti con la sindrome di Sjögren, una malattia autoimmune che interessa le ghiandole esocrine, sviluppano l’infiammazione della ghiandola salivaria e hanno ridotto la produzione di saliva. Analogamente, la produzione di saliva è gravemente compromesso in pazienti che ricevono radioterapia per i tumori testa e collo. Modelli del roditore, sviluppati per simulare queste condizioni cliniche, facilitano la comprensione della patogenesi della malattia e consentono lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Pertanto, la capacità di accurata, riproducibile e ripetutamente misurare la funzione della ghiandola salivaria in modelli animali è fondamentale. Sulla base di procedure precedentemente descritte in letteratura, è stato sviluppato un metodo che soddisfa questi criteri ed è stato usato per valutare la funzione della ghiandola salivaria in topi. Un ulteriore vantaggio di questo nuovo metodo è che è facilmente imparato e ha poca variazione inter-operatore. Funzione della ghiandola salivaria è valutata come la quantità (peso o volume) o velocità (mL/min) di saliva prodotta in risposta alla stimolazione di pilocarpina. La saliva raccolta è una buona fonte per le analisi del contenuto proteico, le concentrazioni nell’immunoglobulina e altre biomolecole.

Introduction

Le ghiandole salivari producono la saliva in risposta ad una varietà di stimoli neurologici e meccaniche1. Gli stimoli sono trasportati attraverso il sistema nervoso simpatico e parasimpatico ai recettori adrenergici e colinergici nella ghiandola. Pilocarpina è un agente colinergico, para-simpaticomimetici che agisce prevalentemente sui recettori muscarinici. Nella ghiandola salivaria, induce la produzione di saliva, agendo sui recettori muscarinici M31. Produzione di saliva dopo somministrazione di Pilocarpina è un indicatore della capacità di rispondere alla stimolazione delle ghiandole salivarie ed è comunemente usata come misura della funzione della ghiandola salivaria.

Misurazione precisa della produzione di saliva è fondamentale nello studio delle malattie della ghiandola salivare, tra cui la sindrome di Sjögren2 e ferita di radiazione che segue la testa e del collo cancro trattamento3. Diversi metodi sono stati sviluppati per misurare la produzione di saliva nei roditori. Questi includono diretto inserimento di una canula del dotto escretore salivario4, la raccolta di saliva dalla cavità orale sotto vuoto5e insieme utilizzando vetro capillari6 o una micropipetta7,8, 9. dirigere l’incannulamento del dotto salivare fornisce saliva più accurata e pura. Tuttavia, questa è una procedura tecnicamente impegnativa e il potenziale per causare lesioni ductal preclude collezioni ripetitivo saliva dall’animale stesso. Raccolta della saliva sotto vuoto può portare a risultati variabili dovuto essiccamento della saliva dal tubo. Questa perdita è esagerata ulteriormente in topi con ridotta salivazione. Tubi capillari in vetro permettono la raccolta di saliva per analisi successive, tuttavia, cambiamenti nella viscosità della saliva secreta nello stato malato previene efficiente riempimento del capillare. Inoltre, tentativi di spazzare la cavità orale per raccogliere i residui della saliva possono provocare lesioni. Il metodo di dispensare consente per la collezione completa, e per lo stesso operatore, è notevolmente coerente tra esperimenti. Tuttavia, per ragioni sconosciute, questo metodo Mostra una variazione significativa tra operatori diversi. Pertanto, per consentire paragoni adeguati, diventa imperativo che l’operatore stesso esegue tutti gli esperimenti relazionati a un progetto specifico. Chiaramente, questo rappresenta un grande svantaggio per un laboratorio.

Per superare questi problemi, è stata sviluppata una procedura che combina saliva raccolta metodi usati per gli esseri umani e roditori. Il metodo tampone, descritto di seguito per misurare il volume di saliva indotti da pilocarpina è semplice, riproducibile, non influenzato da parte dell’operatore e può essere eseguito più volte nello stesso animale. Inoltre, permette la raccolta di saliva per successive analisi di proteine, immunoglobuline o altre biomolecole.

Protocol

Il protocollo descritto di seguito è stato approvato dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale e segue gli orientamenti etici stabiliti dal National Institutes of Health. Tutti i dati presentati in questo rapporto sono stati generati utilizzando topi femminili che erano 10-12 settimane di età. Sono stati utilizzati i seguenti ceppi di topi: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S e F1 (B6XA/J). Tutti i topi sono stati alloggiati in gabbie di barriera (5 animali per gabbia) in condizioni da organismi patogeni specifich…

Representative Results

Nei sistemi modello sperimentale del topo, la capacità di produrre saliva in risposta alla stimolazione di Pilocarpina è usata come un indicatore della funzione della ghiandola salivaria. La produzione di saliva è stata misurata in 11-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6 il metodo tampone. In Figura 1A, i risultati sono espressi come la quantità di saliva (mg) raccolta seguendo le dosi aumentanti di pilocarpina. Alla dose di 1 mg/kg di peso corporeo, a…

Discussion

La produzione di saliva è un processo complesso ed è influenzata da molti fattori. Di conseguenza, la funzione della ghiandola salivaria in animali da laboratorio di misura può essere una sfida. Un’ulteriore sfida è che le misurazioni ripetute della funzione della ghiandola salivaria nello stesso animale sono necessari per stabilire l’inizio della malattia o per dimostrare il recupero dopo il trattamento.

Il metodo tampone descritto in questo rapporto è tecnicamente semplice da eseguire c…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dal National Institutes of Health, National Institute of Dental e Craniofacial Research (DE025030).

Materials

Chemicals for saliva collection
Pilocarpine hydrochloride Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA B21410 Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC
Name Company Catalog Number コメント
Anesthesia Mix solution Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.
Zetamine (Ketamine hydrochloride) Vet One, Boise, Idaho, USA C3N VT1 Stock is 100 mg/mL
Anased (Xylazine) Med-Vet International, Mettawa, IL, USA RXANASED-20 Stock is 20 mg/mL
Isotonic sterile saline Vet One, Boise, Idaho, USA 501032 Used as diluent
Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) Henry Schien, Dublin, OH, USA 48272 Used to prevent eyes from drying during the procedure
Name Company Catalog Number コメント
Materials for saliva collection
SalivaBio Children's swab Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA N/A Individually wrapped swabs
50 mL polypropylene tubes VWR, Radnor, PA, USA 89004-364 Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.
Microcentrifuge tubes 0.6 mL VWR, Radnor, PA, USA 87003-290 Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles
Microcentrifuge tubes 2 mL VWR, Radnor, PA, USA 87003-298
Insulin Syringes with permanently attached needles Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 324702
18 gauge regular bevel needles Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 305195
Sterile scalpel blade #11 Integra York Inc PA, USA 4-311
Microdissecting forceps Roboz, Gaithersburg, MD, USA RS-5139 Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length
Label tape Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA sc-224487
3 channel timer Amazon.com, Seattle, WA, USA B06W2KCYVN
Analytical Balance Mettler Toledo, Columbus OH, USA
Name Company Catalog Number コメント
Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction
LPS Invivogen, San Deigo, CA, USA tlrl-b5lps Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip
Imject Alum adjuvant Thermo Scientific 77161 Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse
Rabbit anti-Ro52 antiserum Generated in lab Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52
Name Company Catalog Number コメント
Chemicals/ Kits for saliva analyses
Salivary lysozyme estimation
EnzChek Lysozyme Assay Kit Molecular Probes, Eugene, OR, USA E-22013 Used as per manufacturer's instructions
Name Company Catalog Number コメント
Salivary IgA estimation by sandwich ELISA
Mouse IgA Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 0106-01 Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL
Goat anti- mouse IgA unlabeled Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 1040-01 Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer
Goat anti- mouse IgA HRP Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 1040-05 Detection antibody used at 1:4000 dilution
TMB substrate Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 555214 Used as per manufacturer's instructions
Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates Thermo Scientific, Rochester, NY, USA 3855
Name Company Catalog Number コメント
Salivary protein estimation
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate BioRad, Hercules, CA, USA 5000006 For protein estimation as per manufacturer's instructions

参考文献

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記事を引用
Bagavant, H., Trzeciak, M., Papinska, J., Biswas, I., Dunkleberger, M. L., Sosnowska, A., Deshmukh, U. S. A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice. J. Vis. Exp. (131), e57203, doi:10.3791/57203 (2018).

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