Протокол для лабораторных жилья из бирюзы Пецилиевые рыбы (Nothobranchius furzeri)

Рыбы поднимаются на 28 ° C в системе рециркуляции воды (см. параметры воды), с 10-20% ежедневно водоотведения. Рекомендуется использовать три различных танк размеры: 0,8 Л, 2.8 L и 9,5 л Каждый танк получает постоянный воды 2 мл/сек. 1. реагенты подготовка (не включены в материалы) Примечание: Африканский бирюзовый Пецилиевые рыбы (Nothobranchius furzeri) может предоставляться из установленных лабораторных запасов. Ежегодный Пецилиевые рыбы сушки устойчивые эмбрионы могут быть отправлены по почте. Важно, чтобы корабль эмбрионов в диапазоне температур 8-30 ° C. Готовят раствор гуминовых кислот (штриховка), растворяя гуминовые кислоты 1 г/Л в системе воды. Автоклавы и хранить при 4 ° C до 10 недель. Для приготовления HUFA Artemia обогащения, добавьте HUFA обогащения артемии Хэтчер ежедневно в концентрации 500 мкл/Л раствора артемии. Готовят раствор метиленового синего, растворяя 100 мкл/Л Стоковый раствор метиленового синего в воде ранее газобетона системы. Так как метиленовый синий свет чувствительных, сохранить решение в темных бутылках, или накрыть фольгой. Магазин на RT. Подготовьте кокосового волокна как твердый субстрат для инкубации зародыш. Альтернативно используйте фильтр бумага (см. раздел 1.5). Замачивают кокосовое волокно с дистиллированной водой. Автоклавы и хранить при 4 ° C на срок до 5 недель. В день передачи эмбриона Подготовьте чашку Петри с влажной кокосового волокна. Заполните диаметром 90-мм Петри с кокосовое волокно под зонт и рядом с пламя, чтобы уменьшить загрязнение, дрожжей и бактерий. Компактная кокосовое волокно на высоту до 1 см, стерильной салфеткой. Удалите большую часть влаги из кокосового волокна, нажав бумажное полотенце поверх плиты, позволяя бумаги, чтобы поглотить излишки воды. Тепла металлической ложкой над пламенем и нажмите вниз на всей поверхности кокосового волокна. Это предотвращает кокосового волокна грибковых/бактериального загрязнения. Подготовьте документ фильтр как твердый субстрат для инкубации зародыш. В день передачи эмбрионов место 3 слоя фильтровальной бумаги дисков, которые соответствуют Петри 90 мм. Добавьте 5 мл раствора гуминовые кислоты сохранить влажность. 2. Разведение Разведение бирюзовый Пецилиевые рыбы для обслуживания штаммПримечание: После этого протокола, половая зрелость достигается в ~ 4 недель после вылупления и плодовитость пиков между 7-9 недель. Важно отметить, что плодовитость зависит от питания Частота и качество продуктов питания; Таким образом по крайней мере два кормления на разведение танк в день рекомендуется для повышения доходности эмбрионов (см. раздел 5.6.) Установки размножения танк 9,5 Л. Заполнение системы водой и добавьте один мужчина и две девушки рыбы. Как мужчины африканского бирюзовый Пецилиевые рыбы отображения доминирование во время спаривания, которые могли бы привести к притеснения женщин, выберите мужчина с размером чуть меньше тела чем самка уменьшить спаривания стресс и увеличить репродуктивного вывода. Настройка 5-недельных самцов с 6/7-недельных самок. Заполнить пластиковый контейнер (10 x 10 x 5 см) с газобетона песком, достижения окончательного глубина ~ 2-3 см и коробка песка в центре размножения танка. Пусть бирюза Пецилиевые рыбы породы непрерывно и урожай эмбрионов для инкубации зародыш раз в неделю.Примечание: Использование песка субстрата создает проблемы для систем централизованного фильтрации и должны быть заменены альтернативными методами в будущем. Возможных вариантов может быть использование данио рерио Животноводство танков. Разведение для трансгенезПримечание: Эмбрионов для инъекции должны быть синхронизированы на стадии одной ячейки, и это требует, что они собираются, сразу же после оплодотворения. Чтобы урожай одномоментная клеток эмбрионов для инъекций и создания трансгенных линий, установите разведения танк с один мужчина и две женщины рыбы (так же, как 2.1.). За два дня до коллекции эмбриона, изолировать мужчин в отдельные емкости и держать мужчин в визуальный контакт с взрослых самок. В день сбора добавить мужчин и коробка песка бак размножения и пусть они икру 2 h. 3. эмбриона животноводства Эмбрион коллекцияПримечание: Эмбриона коллекции выполняется путем просеивания и уборки эмбрионов от коробка песка. При нормальных условиях каждая коробка песка должен содержать от 30 до 200 эмбрионов. В день сбора удалите коробка песка из резервуара для размножения. Очистить поле песка в сито (штамм размером ~0.9 мм) и промойте водой системы. Это можно сделать через большой резервуар для сбора песок для автоклавирования. Частично погружайте фильтр в системе воды и вихревой мягко, позволяя эмбрионов в группу вместе, в центре. Собирайте эмбрионов с 10 мл пипетка Пастера. Трансфер эмбрионов до 90 мм Петри в ~ 40 мл воды системы. Осмотрите эмбрионов в Петри под стереомикроскопом света и удалить эти представления разрыва хориона и признаки повреждения. Перейти непосредственно к отбеливанию эмбриона.Примечание: Всегда используйте один фильтр на штамм рыбы с целью предотвращения потенциальных загрязнений кросс штамм эмбриона. Эмбрион отбеливанияПримечание: Эмбриона отбеливания предотвращает микроорганизмов, присутствующих в баках рыб от загрязняющих инкубации СМИ. До отбеливания, используйте одноразовые пипетки Пастера для удаления системы воды из Петри, содержащий собранные эмбрионов. Чтобы предотвратить нежелательные грибковых и бактериальных роста, добавьте 50 мл свежеприготовленные H2O2 (1% v/v в воде газобетона системы) собранных эмбрионов. Встряхните эмбрионов за 5 мин на низкой скорости в Петри 90 мм в 50 мл раствора. Удаление H2O2 решения с одноразовой пипетки Пастера и мыть эмбрионов три раза за 5 мин с 50 мл раствора метиленового синего. Удалите раствор метиленового синего. Добавьте 50 мл (1% v/v в воде газобетона системы) H2O2 эмбрионов и трясти за 5 мин. Удаление H2O2 решения и стирать три раза за 5 мин с 50 мл раствора метиленового синего. Инкубируйте эмбрионов на 28 ° C для увеличения синхронный эмбрионов развития, при максимальной плотности 100 эмбрионов за 90 мм Петри в 40 мл раствора метиленового синего.Примечание: Не распространяются инкубации зародыш в отбеливающий раствор. Это может привести к повреждению яйцо хориона и увеличения смертности эмбрионов. Эмбрион отбеливание может вызвать основных физико химических изменений в яйцо Хорио, которая может привести к измененным Хорион физиологии и инкубационные успех. Инкубации зародыш в Метиленовый синийПримечание: Жидкость инкубации в раствор метиленового синего предотвращает рост паразита и позволяет обнаружение мертвых зародышей и неоплодотворенных яиц. Осмотрите инкубирован эмбрионов, удаление любых мертвых эмбрионов (запятнана синий Метиленовый синий) из Петри блюдо, чтобы предотвратить грибковые и бактериальные загрязнения, которые влияют на выживание живых здоровых эмбрионов. Удалите старый раствор метиленового синего и заменить свежий раствор. Возвращение Петри в инкубатор 28 ° C (рис. 1A). В течение 7-10 дней убедитесь, что развитых эмбрионов Показать видны черные глаза. Передача этих эмбрионов кокосового волокна или твердый субстрат средний фильтр-бумаги (рис. 1B). Сохранить неразвитой эмбрионов в метиленовым синим, ежедневно контролировать и передать средне твердый субстрат, когда черные глаза разработали. Повторите шаги 3.3.1-3.3.3 ежедневно эмбрионы были видны черные глаза.Примечание: Постоянное воздействие эмбрионов Метиленовый синий может вызывать долгосрочные изменения в физиологии взрослых рыб. Перенос эмбрионов в фильтровальную бумагуПримечание: Бирюзовый Пецилиевые рыбы эмбрионы могут развиваться на сухой субстрат, изложив природных условий. Кроме того сухие эмбриона инкубации позволяет исследователям для синхронизации эмбрионов и Люк их в тот же день. У развитых эмбрионов будут видны черные глаза в течение 7-10 дней, используйте одноразовые пипетки Пастера или тонкой Изогнутый пинцет для переноса эмбрионов с раствор метиленового синего на тарелку ранее готовы картоны. Спред эмбрионов ~ 5 мм друг от друга с щипцами, до 100 эмбрионов за 90 мм пластины (рис. 1B). Уплотнение Петри с парафина. Инкубируйте эмбрионов на 28 ° C на 2-3 недели, до тех пор, пока они полностью разработали Золотой ирисы и готовы для штриховки (рис. 1 c).Примечание: Не затягивать инкубации готов к Люк эмбрионы дольше, чем 2 недели, как их жизнеспособность будет резко сокращено. Перенос эмбрионов для кокосового волокнаПримечание: Газобетона, стерильные кокосового волокна (или органический торф) может использоваться как действительный альтернативные средства для инкубации твердый субстрат. Используйте одноразовые пипетки Пастера или тонкой Изогнутый пинцет для переноса эмбрионов с раствор метиленового синего на готовые к использованию кокосового волокна пластину. Распространения эмбрионов ~ 5 мм друг от друга, до 100 эмбрионов за 90 мм пластины (рис. 1B). Уплотнение Петри с парафина. Инкубируйте эмбрионов на 28 ° C на 2-3 недели, до тех пор, пока они полностью разработали Золотой ирисы (например, на рисунке 1 c).Примечание: Для длительного хранения (до одного года), передавать эмбрионов в 3-дневный пост коллекции от решения метиленовым синим твердый субстрат пластины на 17 ° C. Инкубируйте эмбрионов до тех пор, пока они разрабатывают черные глаза. 4. инкубационные бирюзовый Пецилиевые рыбы Примечание: Бирюзовый Пецилиевые рыбы эмбрионы могут успешно вылупились в гуминовые кислоты раствор14. С помощью тонкой Изогнутый пинцет, передача тщательно 50-100 развитых эмбрионов в поле штриховкой, наполненный гуминовые кислоты раствор при 4 ° C. Гуминовые кислоты раствор состоит из гуминовые кислоты 1 г/Л в воде системы. Автоклавы и хранить при 4 ° C до 10 недель. Убедитесь, что все эмбрионы полностью погружены. Гуминовые кислоты раствор должен быть мелкой, не глубже, чем 2 см.Примечание: Низкая температура гуминовые кислоты раствор улучшает штриховки и полное погружение эмбрионов в решении позволяет синхронизированные штриховкой. Поместите поле штриховки в инкубатор штриховкой 28 ° C. Покрывают поле штриховки с крышкой. Поставлять достаточно аэрации, подключите по НКТ с подачей воздуха штриховкой.Примечание: Не достаточно аэрации во время инкубации приводит к высоким уровнем СРЮ не в состоянии заполнить газового пузыря («живот слайдер» фенотипа, см. Примечание в разделе 5.1) На следующий день после вылупления для поддержания надлежащего качества воды в поле штриховкой, добавьте газобетона системы воды один раз в день в пропорции 1:1, сохраняя окончательный глубина 2 см. Переноса эмбрионы соперниц обратно на твердом субстрате и попытка штриховки на неделю позже.Примечание: После вылупления, бирюзовый Пецилиевые рыбы способны легко поглощения и потребляют живой пищи. Для оптимального роста кормить мальков два раза в день с избыток недавно вылупившиеся артемии (Artemia salina). В знак полного насыщения является оранжевого цвета животы СРЮ после каждого кормления 10-15 минут. Сифон, избыток, недоеденные и разложившихся артемии с помощью пипетки Пастера на ежедневной основе. 5. привлечение несовершеннолетних и взрослых рыб На пять дней после вылупления переместите несовершеннолетних в системе рециркуляции воды. Используя одноразовые пластиковые пипетки (или пластиковой ложкой), тщательно передачи пять несовершеннолетних за 0,8 Л бак с экраном Фрай 400 мкм (рис. 2).Примечание: Вполне возможно, что часть несовершеннолетних Пецилиевые рыбы не заполнили газового пузыря, привело типичных «живот ползунок» фенотип, характеризуется рыбы, не достигнув надлежащего плавучести, заставляя их непрерывно плавать, вызывая тяжелые пороки развития в взрослых рыб. Эти рыбы не могут быть использованы для выживания анализов или эффективного разведения и должны подвергаться цензуре. Выкармливают птенцов два раза в день с свеже насиженным артемии в избытке до 14 дней после вылупления. Сифон мусора из нижней части каждого танка ежедневно. В возрасте 14 дней передачи молоди 2,8 Л бак оснащен экраном Фрай 850 мкм. С этого момента пометьте каждый танк с ID рыба, указанием Люк Дата, штамм информацию, Пол рыбы и рыбы идентификационный номер (рис. 3). Для выживания анализов индивидуально дом каждой рыбы в одной емкости с этого момента. На следующие 7 дней выкармливают птенцов два раза в день с ~ 2 мл артемии в рыбы. На этом этапе рыбы могут быть дополнены червей живой крови 1-3 (в случае, если личинки червя крови слишком велики для рыбы, нарезать их на более мелкие куски с лезвием бритвы). Для предотвращения ухудшения качества воды, сифон недоеденные продовольствия и дополнительных отходов дважды в неделю. После 3 недель от штриховкой удалите Фрай экран из задней части танка и начать кормить каждой рыбы два раза в день ~ 2 мл артемии и 0,5 мл крови червя. На данном этапе несовершеннолетние должны достигли тела размером 1 см и должен быть способен глотая полноразмерным кровь червя. На 4-недельного возраста кормят ~ 2 мл артемии и 1 мл крови червя каждой рыбы два раза в день. Самки могут совместно размещены на плотности до 3 самки за 2,8 Л бак. На этом этапе обеспечить, что рыбы достигают полного полового созревания. Проверка на наличие больших спинной, Анальный и хвостовой плавники с признаками окраска самцов и круглых животы полной яиц в женщин.Примечание: Повышение взрослых рыб в отдельные емкости для выживания когортных исследований может негативно сказаться на поведение рыб и здоровье. Однако Группа жилье для выживания когортных исследований добавляет значительные отягощающих факторов благодаря созданию социального господства и мужской территорий, ведущих к строгим социальной иерархии. 6. питание Примечание: Лаборатория бирюзовый Пецилиевые рыбы можно скармливать сочетание ребенка артемии (науплийартемии Салина ) и кровь червя (Chironomus spp. личинок). Бирюзовый Пецилиевые рыбы Фрай питаются исключительно ребенка артемии. Несовершеннолетних и взрослых рыб кормят два раза в день артемии и кровь червя (рис. 2). В идеале рыба может быть использована несколько раз в день, превышает 2 кормления указывается в настоящем Протоколе. Культивировании артемии Добавить 10 Л воды обратного осмоса (RO) и 350 g Красного моря соли в рассоле креветки Хатчер и растворить аэрации с трубки аэрации. Обогащают культуру с 5 мл высоко ненасыщенных жирных кислот (HUFA). Добавьте 20 г цисты артемии в раствор штриховкой. Проверьте, что цисты артемии не плавают на поверхности воды и обеспечить надлежащее оксигенации и распространение культуры.Примечание: Ежедневно аликвоты сухой артемии кисты могут храниться при 4 ° C. Во второй половине следующего дня питания культуры с другой Алиготе 5 мл HUFA. Заготовка насиженным артемииПримечание: После ~ 36 ч от начала культуры, рассоле креветки готовы для сбора урожая (instar II фаза). Собирать 5 L культуры в контейнере с помощью крана на нижней части инкубатора и пусть сидят в течение 10 мин. После 10 минут удалите артемии снарядов (коричневого цвета) из верхней части контейнера 5 Л и фильтровать насиженным артемии (оранжевый цвет) через сетку. Обратите внимание на исключения в отложениях найдены в нижней части контейнера, как она содержит не вынашивали яйца и мертвых артемии. Промойте вылупились артемии с воды RO в 2 Л контейнер и пусть сидят в течение 10 мин. После 10 минут фильтр артемии снова через сетку и собирать в 2 Л воды RO. Повторите предыдущие три шага, до тех пор, пока решение артемии свободен от не вылупились кисты и артемии снарядов. Передача артемии от 2 Л контейнер в сжать бутылки для кормления.Примечание: Культивировании артемии является достаточно прочной и надежной. Однако чтобы избежать нехватки артемии в случае неудачной штриховкой, можно использовать меньше резервного копирования выводные (500 мл). Настройка резервного копирования Хэтчер Растворите 17,5 г Красного моря соли в 500 мл воды RO аэрации. Обогащают культуру с 500 мкл HUFA. Добавьте 2 g цисты артемии. После 18-24 ч поставка культуры еще раз с 500 мкл HUFA.Примечание: рассоле креветки готовы пожинать после ~ 24 h. Подготовка живая кровь червя Непосредственно до кормления, фильтр соответствующее количество крови червя через сито с помощью Обратноосмотическая вода.Примечание: Червь живой крови могут храниться при температуре 4 ° C для 7-10 дней. Промойте кровь червя с небольшим количеством воды RO в пластиковый контейнер. С пластиковой Пастер пипетки (узкий кончик удалены), занимают кровь червя смесь для кормления.Примечание: Питание лаборатории Пецилиевые рыбы колоний с живой пищи от ООН контролируемых источников добавляет риск для внешних загрязнений от паразитов и потенциально патогенных микробных сообществ. В будущем должны разрабатываться канал специальных стерильных рыбы. 7. Пецилиевые рыбы лаборатории штамм генотипирования Примечание: Различать среди штаммов бирюзовый Пецилиевые рыбы, а также для определения пола в пределах каждого штамма, конкретных генетических (микроспутника) маркеры можно использоваться9 (Таблица 1). Отбор проб Надежно удерживайте рыбы в сетку верхней части влажной губкой. Тампоном 2-3 весы из тела рыбы из крышечки на хвостовой плавник с помощью ватных тампонов. Весы от тампона и весы 2-3 в 1 мл, содержащих раствор NaOH (200 мкл 0,5 моль/Л NaOH, β-меркаптоэтанол 1% и 0,5% поливинил пирролидона). Спин трубы ПЦР для 15 s, чтобы убедиться, что весы полностью погружен в растворе NaOH. Геномная ДНК изоляции Проинкубируйте образцы для 20 мин при 95 ° C. Cool на RT, нейтрализации образца с 1/10 объема 1 М трис-HCl, рН 8.0. Центрифугуйте образцы для 5 минут на полной скорости. 8. параметры воды Примечание: Земледелие организмов, которых используется взрослых фенотипирование требует условий высокостабильных животноводства на протяжении всей жизни целевых видов. Таким образом культивирования водных организмов, таких как бирюзовый Пецилиевые рыбы, требует строгого контроля параметров воды. Рециркуляции воды, с дополнительные четыре шаги фильтрация воды, обеспечивает надежную основу для достижения контроля над параметры воды, обеспечивая все танки на тех же условиях воды с течением времени. Рекомендуется для воссоздания системы воды от обратного осмоса (RO) воды, добавил с коммерческой морской соли и натрия бикарбоната. Схема системы циркуляции воды: во-первых, сточные воды от рыбы цистерны потоков через твердые частицы металла фильтр, который захватывает все остатки пищи не едят и крупных частиц. Металлические фильтры промывают три раза в неделю; Во-вторых после первой механической фильтрации, вода в больших грязевиков и затем закачивается в биофильтр, где бактерии конвертировать аммиака, нитритов и нитратов; В-третьих от биофильтр, вода перекачивается до 25 мкм фильтр рукава, которые ловушку точного размера частиц. Наконец вода течет через ультрафиолетового (УФ) лампы, которые стерилизации воды от бактерий и вирусов. После этих четырех шагов фильтрованная вода возвращается в рыбы цистерны. Чтобы уменьшить рост микроорганизмов в цистернах, предотвратить накопление нитратов и уменьшить общего соленость, 10-20% воды, системы удаляется на ежедневной основе. Поддержание постоянной температуры воды на 28 ° C, вода рН константа в пределах 7.0 до 7,5. Хотя Пецилиевые рыбы терпеть широкий спектр солености, чтобы избежать oodinosis, поддерживать теплопроводности в пределах диапазона 650-710 микро Siemens. Свет/темно цикла год 12 h обеспечивает колонии здоровья и производительности.Примечание: Пецилиевые рыбы может терпеть проводимости воды до 1500 микро Siemens.