トリコスタチン A とビタミン C の組合せ治療が体細胞核移植によるマウスのクローニングの効率を向上します。

動物のすべてのプロシージャは、ケアと実験動物の使用のための近代大学のガイドラインに適合。 1. 培地の調製 成る 95 mM の NaCl, KCl 2.5 mM、0.35 mM KH2PO4, 0.2 mM MgSO4 · 胚培養に変更された KSOM (mKSOM) メディアを準備します。7 H2O、1.71 mM CaCl2 ·2 H2O、0.2 mM D-(+)-グルコース、0.2 mM ピルビン酸ナトリウム 1.0 mM 1.0 g/L ポリビニルピロリドン (PVP)、25.07 mM NaHCO3、L-グルタミン 10 mM DL-乳酸ナトリウム、0.05 g/L、ペニシリン、0.05 g/L の滅菌水にストレプトマイシン。 胚操作、81.5 mM の NaCl、KCl、4.8 mM 1.7 mM CaCl2 · から成る Hepes バッファー CZB (HCZB) メディアを準備します。2 H2O、1.18 mM MgSO4 ·7 H2O、1.18 mM KH2PO4、0.11 mM EDTA ·36.1 mM 2Na ナトリウム DL-乳酸、5.55 mM D-(+)-グルコース、0.025 g/mL ペニシリン、ストレプトマイシンの 0.035 g/L、0.014 mM フェノール レッド、1.0 g/L ポリビニル アルコール、5.0 mM NaHCO3と 20.0 mM Hepes ナトリウム塩を滅菌水。 卵母細胞の活性化のため活性化メディアの準備: 50 nM TSA、2 ミリメートル グリコールエーテルジアミン四酢酸、5 μ G/ml サイトカラシン B (CB) と 5 mM SrCl2と mKSOM 培。 2. 準備の純水ウシ血清アルブミン (地場) ウシ血清アルブミン (BSA) の 1.2 g を常温 (12% の最終的な集中) 滅菌水 10 mL に溶かしてください。 穏やかな攪拌しながら常温で滅菌水に BSA の 12% を用意して上記に混合イオン交換樹脂ビーズ約 0.12 g を追加します。 ビーズが青緑色から色を変更するとき金にピペットを使用して培養上清中の解決策を回復します。新鮮なとビーズを置き換えるもの (図 1)。メモ: ビーズの交換は一度だけ実行されます通常。おそらく、完全な脱塩し、いくつかの代替が必要です。ビーズの色が変わらない場合、ガイドとしてのみゴールド ブルー グリーン、そのイオン交換が完全なことを示します。 ビーズの色の変化がないことを確認した後、ソリューションを回復します。注: 回収液は曇りになると、遠心 (175 x g、5 分) のフィルターの目詰まりを防ぐために。 回復した補足 10.5% NaHCO3の 250 μ L でソリューション。注: このプロセスは、ph を中和する地場ソリューション用です。ただし、NaHCO3が不可欠であることができます。 0.45 μ m のフィルターを使用して上清を殺菌し、地場原液として-20 ° C で保存します。 3. 採卵 注: すべてのマウスは、光制御とエアコン付きの客室で維持されました。 妊馬血清性腺刺激ホルモン (PMSG) 7.5 IU の腹腔内投与による各女性の B6D2F1 マウス (高齢者は 8-10 週間) のスーパー排卵とひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) 48 h PMSG 投与後の 7.5 IU。 頚部転位 14-16 h で安楽死 hCG 注射後。標準的な解剖技術13を用いた生殖管にアクセスする腹部を切開します。簡単に、皮をつまむし、ハサミで正中線で小さな横切開を行います。皮膚切開部の上下にかかわらずしっかりと押しながらヘッドとテールに向かって皮膚を引っ張ったりします。はさみを使って腹膜を切り取って腸のコイルをプッシュ方法のうち、子宮、卵管、卵巣の 2 つの角の存在を確認します。 ストレートのハサミとピンセットで卵管を勧めた、表面の血を拭くためのフィルター紙のシート上に配置します。鉱物油で卵管を設定します。解剖針を使用して卵管の膨大部をカットし、200 μ L 滴 0.1% ヒアルロニダーゼと HCZB 中に卵管の膨大部からくる卵丘卵子複合体を移動します。温暖化のプレート上で 5 分間インキュベートします。注意: 0.1% ヒアルロニダーゼと HCZB 中 10 分以上の露出は卵母細胞の有害でしょう。 転送第 2 減数分裂中期 (MII) 段階卵子 mKSOM 中含まれている 0.3% 地場いくつかの残りの卵丘細胞を顕微鏡下で – 卵子複合体から卵丘細胞が解放されることを確認します。上下にピペッティングにより MII 期卵子を 4 回、洗って (のピペットを使用して < 100 μ m の内径) mKSOM 中含まれている 0.3% 地場残りの卵丘細胞のデタッチのために。注: 小さなピペットの使用卵丘細胞の剥離が容易になります。 MKSOM 中含まれている 0.3% 地場 37 ° c 未満 5% に Mll ステージ卵をインキュベート摘出まで CO2インキュベーター。注:、卵母細胞のそれより若干大きい直径の小さなピペットをお勧めします。 4. ドナー細胞の核移植のための準備 手順 3.3 3.5 後、裸出卵子は卵丘卵子複合体から分離されます。顕微鏡下でピペットを使用して 6% 地場と HCZB 培地に 0.1% ヒアルロニダーゼと HCZB 培地で卵丘卵子複合体から分散して残りの卵丘細胞の少量 (約 2 μ L) を転送します。 37 ° c まで法に必要な地球温暖化のプレートに 6% 地場と HCZB 中に卵丘細胞を配置します。注: とき線維芽細胞 (e.g。、マウス胎児線維芽細胞) が培養皿からセルを外し、ペレットにそれらを遠心分離機ドナー細胞として使用する。HCZB 培 6% 地場における細胞のペレットを再懸濁します。 5. 卵母細胞の核出 0.9 g PVP を 10 mL HCZB 中に追加することによって 9 %pvp メディアの準備、(4 ° C)、一晩冷蔵庫で保存し、0.45 μ m のフィルターを使用してそれを殺菌します。 CB 原液 (1 Mg/ml の濃度) を準備するには、ジメチルスルホキシド (DMSO) 5 mL に CB の 5 mg を追加します。HCZB 中 (最終濃度 5 μ G/ml) CB 原液を希釈し、摘出解決策として使用します。 吸い込むと滅菌ピペットを吐き出す HCZB 培 5 μ G/ml CB (摘出ソリューション) の 20 μ L Mll ステージ卵母細胞を洗い (内部の直径: 150 μ m 200 μ m から)。5 回洗濯手順を繰り返します。摘出プロセスを開始する前に摘出ソリューションで温暖化のプレートに約 10 分を待ちます。 図 2 aに示すように、核出術室を準備します。核出術室に転送 Mll 卵子は吸い込むと吐き出すピペットを使用して、(内部の直径: 150 μ m 200 μ m から);摘出ソリューションの 4 μ L を置き、チャンバー内に鉱物油をカバーします。注: 代わりに、商工会議所、60 mm のペトリ皿のカバーを使用することができます。 スピンドルと室温で顕微鏡 (400 倍) で MII 期卵子の染色体を識別します。ホールディング ピペット、マイクロ ピペットを使用して (図 2 b) 位置 3 または 9 では染色体とスピンドルの位置決め、顕著な第一極体と Mll 段階卵子に合わせます。注: 使用される顕微鏡は、合計で 400 倍の倍率のレンズをあります。また、対物レンズ N.A は 5 X/0.12 と 40 X/0.55 です。ピペットのピエゾ パルス駆動透明帯の急速な掘削を許可します。さらに、レーザー システム (例えばXYClone) もピエゾ駆動システムの代わりに透明帯の掘削に使用可能です。 3 – 6、ピエゾ パルス強度を設定し、ピエゾ パルス駆動マイクロ ピペット (7-8 μ m 内径フラット エンド チップ) を使用して透明帯にドリルします。透明帯に穴を開ける後、完全にスピンドルと細胞質 (図 2) の最低量の染色体を摘出します。注: この処理中に卵がちしっかりと皿の底を付けるまたは BSA14なし媒体によるピペットします。10 分以内摘出を完了する必要がありますと除核卵子がインキュベーターに返却する必要があります。適切な 1 つ摘出で操作することができます卵母細胞数は 10 と 20 の間です。卵母細胞の大きなバッチは、摘出術の手順が繰り返されます。 可視光 (図 2中間)、細胞質の染色体の有無を確認し、mKSOM 培 CB を欠けている 0.3% 地場で除核卵子を徹底的に洗います。37 ° C 未満 5% でインキュベーターに皿を紹介細胞融合までの CO2 。注: 摘出後卵から削除される細胞質含むスピンドルと染色体。 6. 除核卵子ドナー細胞の融合 HVJ エンベロープベクターの準備 凍結乾燥 HVJ-E に冷たい HVJ-E 懸濁液ソリューションの 260 μ L を追加 (キットの材料表を参照してください) とピペットの上下まで十分に中断されました。注: 凍結乾燥 HVJ-E の適切な量は、瓶の中の準備し、260 μ L HVJ-E 懸濁液ソリューション キットに含まれております。 HVJ-E 溶液 5 μ L の因数を準備し、細胞融合まで-80 ° C で保存します。注意: それは温度に敏感なので慎重に氷の上 HVJ-E を扱います。実験、適切にオートクレーブ HVJ-E 材料およびウイルス コンポーネントを完全に不活化するコンテナーの完了後。 細胞融合 使用直前に細胞融合バッファーの 20 μ L で HVJ-E ソリューションの 5 μ L を希釈します。氷の上に使用されるまで薄めた HVJ-E を配置します。注: セル融合バッファーは、HVJ-E キットに含まれます。 図 3 aに示すように、セル核融合炉チェンバーを準備します。ピペットを使用して細胞融合の商工会議所の除核卵子を HCZB 媒体に転送 (内部の直径: 150 μ m 200 μ m から);各ソリューションの場所 4 μ L (HCZB 培ドナー細胞、HVJ-E ソリューション、HCZB 培地、6% BSA 9 %hczb 中 PVP) と鉱物油の約 1 mL とチャンバーをカバーします。注: 適切な除核卵子が 1 つの細胞融合手順中の操作のために部屋に転送される数は、30 に 5 からです。卵母細胞の大きなバッチは、細胞融合手順が繰り返されます。商工会議所、代わりに 60 mm シャーレ カバーできる使用可能な場合。 HCZB 中 400 X magnificationat 室温で顕微鏡下除核卵子を配置します。(6 7 μ m 内径フラット エンドの先端)、マイクロ ピペットを使用してドナー細胞を吸引、HVJ-E 懸濁液ソリューションに細胞を追放します。 その後、卵丘細胞一つずつシリアル細胞融合を有効に、お互いから分離する均等に HVJ-E 懸濁液の解決策を吸い出しなさい。ホールディング ピペットを使用して HCZB 媒体に除核卵子をしてください。ピエゾ パルス (3-6、2 – 3 速の強さ) をマイクロ ピペットで透明帯をドリルします。 透明帯に穴開いたら、卵膜を経由せず卵丘細胞量の 5 倍のボリュームと HVJ-E 懸濁液の解決策と共に、卵膜にしっかりと積雲の細胞を配置します。注: は、卵丘細胞をマイクロ ピペットの 6-7 μ m 内径先端フラット エンドを準備します。ピペットは、平滑リリースを維持するため定期的に 9 %pvp 中を使用して洗浄する必要があります。6.2.5 6.2.3 – の手順は 10 分以内に終えなければならないまたは細胞融合の効率は低くなります。HVJ エンベロープベクターの膜融合活性はオートクレーブ、洗剤、または 70% エタノール投与による不活化します。実験の後の HVJ-E ソリューションを適切に破棄する必要があります。 細胞融合の操作後、速やかに mKSOM 媒体含む 0.3% 地場、卵母細胞を転送し、37 ° C 5% 未満で保育器に移動 1 h の CO2 。 7. 再建された卵母細胞と治療トリコスタチン A とビタミン C の活性化 TSA の準備 3 μ 因数に 5 mM TSA ソリューションを省略し、-20 ° C でソリューションを格納 1 mL の DMSO (12.5 μ M の濃度) に 5 mM TSA 原液の 2.5 μ L を追加します。 活性化中小企業 mKSOM 培地 2 mL に 12.5 μ M TSA 貯蔵液 8 μ L を希釈 (最終濃度 50 nM)。 VC の準備 滅菌のエンドトキシン フリーの水の 1 mL に VC の 1 mg を追加し、-20 ° C で保存 MKSOM 培地 (最終濃度 10 μ G/ml) に VC 原液を追加します。 再建された卵母細胞の活性化 細胞融合後 1 時間は、時期尚早の染色体凝縮 (PCC) 再建された卵母細胞 (図 3 b) 顕微鏡 (400 倍) を使用してを確認してください。 再建された卵子を活性化媒体に転送 (手順 1.3 参照)、TSA を含む、37 ° C 未満 5% で 6 時間インキュベート CO2空気 (図 3)。Pro-核法胚の形成を観察し、適用 2 mKSOM 中含まれている 0.3% (図 2) 地場で TSA 治療のより多くの時間。 VC と mKSOM 培に TSA 治療胚を転送し、 3 D 図で示すように、7 時間孵化させなさい。 VC 治療の 7 時間後 mKSOM 中含まれている 0.3% 地場 VC 治療胚を転送し、37 ° C 未満 5% で 4 日間インキュベート空気中の CO2 。メモ: クローン マウスを生成するためには、通常形態の 2 細胞期胚を転送擬似妊娠したメスマウス (MCH(ICR)) (偽妊娠の 0.5 日)15見つかったら腟栓日の卵管に。19.5 日後帝王切開後着床と新生児の数が記録されます。