Trichostatin a 和维生素 C 的组合治疗提高体细胞细胞核移植克隆小鼠的效率

所有动物规程符合一出大学的指南为实验室动物的关心和用途。 1. 文化媒体的准备工作 为胚培养制备改良的 KSOM (mKSOM) 培养基, 包括95毫米氯化钠、2.5 毫米氯化钾、0.35 毫米的2PO4、0.2 mm MgSO4 ·7H2O, 1.71 毫米 CaCl2 ·2H2O, 0.2 毫米 D (+) 葡萄糖, 0.2 毫米丙酮酸钠, 1.0 毫米 l-谷氨酰胺, 1.0 克/升 Polyvinylpyrrolidone (PVP), 25.07 毫米 NaHCO3, 10 毫米 dl-乳酸钠, 0.05 克/升青霉素, 和0.05 克/升链霉素在无菌水中。 准备 Hepes 缓冲的 CZB (HCZB) 培养基进行胚胎操作, 包括81.5 毫米氯化钠, 4.8 毫米氯化钾, 1.7 毫米 CaCl2 ·2H2O, 1.18 毫米 MgSO4 ·7H2O, 1.18 毫米的.2PO4, 0.11 毫米 EDTA ·2Na, 36.1 毫米 dl-乳酸钠, 5.55 毫米 D (+) 葡萄糖, 0.025 克/毫升青霉素, 0.035 克/升链霉素, 0.014 毫米苯酚红色, 1.0 克/升聚乙烯醇, 5.0 毫米 NaHCO3, 和20.0 毫米 Hepes 钠盐在无菌水中。 准备活化培养基为卵母细胞活化: mKSOM 培养基辅以50毫微米 TSA, 2 毫米 EGTA, 5 µg/毫升细胞松弛素 B (CB), 5 毫米SrCl2。 2. 去离子牛血清白蛋白 (dBSA) 的制备 在室温下将1.2 克的牛血清白蛋白 (BSA) 溶解在10毫升的无菌水中 (最后浓度为 12%)。 在室温无菌水中加入约0.12 克的混合离子交换树脂珠, 以温和搅拌的条件制备12% 的 BSA。 当珠子将颜色从蓝绿色变成金色时, 用吸管来恢复上清液。然后用新的珠子替换 (图 1)。注: 更换珠子通常只执行一次。它可能需要一些替换来完成去离子。仅作为指南, 如果珠子的颜色保持不变从蓝绿色到金子, 它表明离子交换是完整的。 在确认珠子中没有颜色变化后, 恢复解决方案。注: 如果恢复的解决方案变成多云, 离心机, 以防止堵塞过滤器 (175 x g, 5 分钟)。 使用250µL 10.5% NaHCO3来补充恢复的解决方案。注: 此过程用于 dBSA 溶液中和 pH 条件。但是, NaHCO3可以是可有可无的。 使用0.45 µm 过滤器消毒上清液, 并以-20 摄氏度为 dBSA 库存溶液。 3. 卵母细胞收集 注意: 所有老鼠都是在光控和空调房间里保养的。 超排卵每只雌性 B6D2F1 鼠 (8-10 周), 腹腔注射7.5 内孕母马血清促性腺激素 (PMSG) 和7.5 的人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 48 h 后 PMSG 注射液。 在 hCG 注射后, 宫颈脱位 14-16 小时进行安乐死。使用标准解剖技术13切开腹部以进入生殖道。简单地, 捏紧皮肤, 用剪刀在中线做一个小的侧向切口。将皮肤牢牢地固定在切口的上方和下方, 并将皮肤拉向头部和尾部。用剪刀切开腹膜, 把肠子的线圈推出来, 确认子宫、输卵管和卵巢两角的存在。 根除输卵管用小直剪刀和镊子, 放在一张滤纸上擦拭表面的血迹。在矿物油中设置输卵管。然后, 用解剖针切开输卵管的壶腹, 将来自输卵管壶腹的卵母细胞复合物移动到200µL 滴 HCZB 培养基中, 0.1% 透明质酸酶。在暖盘上孵育5分钟。注意: 在 HCZB 培养基中, 0.1% 透明质酸酶的暴露时间超过10分钟对卵母细胞有害。 确认卵丘细胞在显微镜下从卵母细胞中释放, 转移第二减数分裂中期 (产业部) 阶段卵母细胞, 并将剩余的卵丘细胞移植到含有 0.3% dBSA 的 mKSOM 培养基中。然后, 在含有 0.3% dBSA 的 mKSOM 培养基中, 通过吹打 (使用 < 100 µm 内径的吸管) 将剩余的卵丘细胞分离, 洗涤产业部卵母细胞四次。注: 使用小吸管有利于卵丘细胞的脱离。 孵化 Mll 阶段卵母细胞在 mKSOM 培养基包含 0.3% dBSA 在37°c 下 5% CO2孵化器, 直到摘除。注: 建议使用直径略大于卵母细胞的小吸管。 4. 为核转移准备捐助者细胞 3.3-3.5 步后, 裸露的卵母细胞与卵丘-卵母细胞的复合体分离。转移少量 (大约2µL) 的剩余的卵丘细胞分散从卵丘-卵母 HCZB 培养基与0.1% 透明质酸酶到 HCZB 培养基 6% dBSA 使用吸管下显微镜。 将卵丘细胞放在 HCZB 培养基中, 6% dBSA 在37摄氏度, 直到 SCNT 需要。注: 当成纤维细胞 (e. g) 被用作捐献细胞时, 将细胞从组织培养皿中分离出来, 并将其离心成颗粒。并用重悬 HCZB 培养基中含有 6% dBSA 的细胞颗粒。 5. 卵母细胞的摘除 准备 9% pvp 培养基, 添加0.9 克 pvp 到10毫升 HCZB 培养基, 保持在冰箱隔夜 (4 °c), 然后使用0.45 µm 过滤器消毒。 通过加入5毫克的 cb 到5毫升二甲基亚砜 (亚砜), 制备 cb 溶液 (浓度为1毫克/毫升)。用 HCZB 介质 (最终浓度为5µg/毫升) 稀释 CB 溶液, 并作为溶出液使用。 通过消毒吸管吸入和呼气 (内径: 150 µm 至200µm), 在含有5µg/毫升 CB (Mll) 的 HCZB 培养基中冲洗20µL 的卵母细胞。重复洗涤过程五次。在开始摘除过程前, 在变暖板上等待大约10分钟。 准备摘除室, 如图 2A所示。使用吸管 (内径: 150 µm 到200µm), 通过吸入和呼出 Mll 卵母细胞转移到摘除室;放置4µL 的溶出液, 并用矿物油盖住燃烧室。注: 可使用60毫米培养皿的盖子代替腔室。 在室温下, 在显微镜下 (400X) 识别出产业部卵母细胞的纺锤和染色体。定向 Mll 阶段卵母细胞与发音的第一极性身体, 因此纺锤和染色体的定位在3或9点 (图 2B) 位置使用持有的吸管和微。注: 显微镜使用的镜头总有400X 倍的放大倍数。另外, 物镜的物镜为 5 x/0.12 和 40 x/0.55。压电脉冲驱动的吸管允许快速钻井的透明透明。此外, 激光系统 (例如, XYClone) 也可以用于钻孔的透明透明代替压电驱动系统。 将压电脉冲强度设置为 3-6, 然后使用微操作系统吸管 (7-8 µm 内径平端尖端) 钻取到透明透明, 并将其压入脉冲驱动。在透明透明上打开一个孔后, 完全 enucleate 纺锤和染色体的细胞质量最小 (图 2C)。注意: 在这个过程中, 卵母细胞倾向于紧密连接到盘子底部或吸管由于培养基没有 BSA14。在10分钟内, 摘除过程必须完成, 无核卵母细胞需要返回到孵化器。在一个摘除术中可以操作的卵母细胞的适当数量在10和20之间。对于大批量的卵母细胞, 摘除术是重复的。 确认可见光下细胞质中的染色体缺失 (图 2C, 中间), 然后在含有 0.3% dBSA 的 mKSOM 培养基中彻底清洗无核卵母细胞。在 5% CO2下, 将菜式引入孵化器37摄氏度, 直到细胞融合。注: 摘除后, 从 ooplasm 中取出的细胞质含有纺锤和染色体。 6. 供体细胞与无核卵母细胞的融合 HVJ 的制备 添加260µL 冰冷 HVJ 悬浮液冻干 HVJ e (从套件, 见材料表) 和吸管向上和向下, 直到完全悬浮。注: 在瓶中准备适量的冻干 HVJ, 260 µL HVJ 悬浮液包括在试剂盒中。 准备5µL 整除数的 HVJ 溶液, 然后存储在-80 °c, 直到细胞融合。注意: 小心对待冰上的 HVJ, 因为它是温度敏感的。实验完成后, 适当的蒸压 HVJ 材料和容器, 完全灭活病毒成分。 细胞融合 在使用前立即稀释5µL 的 HVJ 溶液与细胞融合缓冲器的20µL。将稀释后的 HVJ 溶液放在冰上, 直到使用。注意: 单元融合缓冲区包含在 HVJ 套件中。 准备单元融合室, 如图 3A所示。使用吸管 (内径: 150 µm 到200µm) 将无核卵母细胞转移到 HCZB 培养基上;将每种溶液的4µL (HCZB 培养基中含有 6%-BSA 用于供体细胞、HVJ 溶液、HCZB medium,9%pvp 在 HCZB 培养基中), 并覆盖约1毫升矿物油的腔室。注: 在一个细胞融合过程中, 适当数量的无核卵母细胞被转移到腔内进行操作是从5到30。对于更大的卵母细胞, 细胞融合过程是重复的。如果有的话, 可以使用60毫米的培养皿盖代替腔室。 在 400X magnificationat 室温下, 将无核卵母细胞置于显微镜下 HCZB 培养基中。用微操作系统吸管 (6-7 µm 内径平端) 吸入供体细胞, 并将细胞排出 HVJ 悬浮液中。 然后将卵丘细胞一个接一个地吸入 HVJ 悬浮液, 使其相互分离, 从而实现串联细胞融合。使用持有吸管将无核卵母细胞保持在 HCZB 培养基中。用压电脉冲 (强度为 3-6, 速度为 2-3) 钻出透明透明与微操作系统吸管。 在透明透明中打开孔后, 将卵丘细胞紧紧地放在卵母细胞膜上, 连同 HVJ 悬浮液, 其体积是卵丘细胞体积的5倍, 不经过卵母细胞膜。注: 准备 6-7 µm 内直径微操作系统吸管的扁端尖卵丘细胞。吸管必须定期清洗使用 9% PVP 培养基, 以保持平滑的细胞释放。步骤 6.2.3-6.2.5 必须在10分钟内完成, 否则细胞融合的效率将会降低。HVJ 的膜融合活性通过热处理、洗涤剂处理或70% 乙醇进行灭活。实验结束后, 必须对 HVJ 溶液进行适当的处理。 在操作细胞融合后, 及时将卵母细胞转移到含有 0.3% dBSA 的 mKSOM 培养基中, 并在 5% CO2下移动到37°c 的孵化器中, 1 h。 7. 重组卵母细胞的活化和 Trichostatin a 和维生素 C 的治疗 TSA 的准备 免除 5 mM TSA 解决方案到3µL 整除数, 并存储的解决方案在-20 摄氏度。 添加2.5 µL 5 毫米 TSA 库存解决方案1毫升亚砜 (浓度为12.5 µM)。 稀释8µL 12.5 µM TSA 库存溶液在2毫升的活化介质和 mKSOM 介质 (最终浓度为 50 nM)。 VC 的制备 将1毫克 VC 加入1毫升无菌内毒素的水中, 并贮存在-20 摄氏度。 将 VC 库存解决方案添加到 mKSOM 介质中 (最终浓度为10µg/毫升)。 重建卵母细胞的活化 细胞融合后一小时, 使用显微镜 (400X) 检查重建卵母细胞 (图 3B) 中的过早染色体凝结 (PCC)。 将重建后的卵母细胞转移到活化介质 (见步骤 1.3), 其中包含 TSA, 并在空气中的 5% CO2下孵育6小时 (图 3C)。观察 SCNT 胚胎中的亲核的形成, 然后在含有 0.3% dBSA 的 mKSOM 介质中应用2小时的 TSA 治疗 (图 2C)。 将 TSA 处理的胚胎转移到 mKSOM 培养基中, 辅以 VC 和孵育7小时, 如图 3D所示。 在 vc 治疗7小时后, 将 vc 处理的胚胎转移到含有 0.3% dBSA 的 mKSOM 培养基中, 并在空气中 5% CO2下孵育4天37摄氏度。注: 在发现阴道插头 (pseudopregnancy 0.5 天)15时, 要生产克隆小鼠, 将形态正常的2细胞阶段胚胎转移到伪怀孕雌性小鼠 (MCH) 的输卵管。19.5 天后, 剖宫产术后植入部位和新生儿的数量被记录在案。