Trattamento combinatorio di tricostatina A e la vitamina C migliora l'efficienza di clonazione topi da trasferimento nucleare di cellule somatiche

Tutte le procedure di animale conformano alle linee guida di Kindai University per la cura e l’uso di animali da laboratorio. 1. preparazione di terreni di coltura Preparare il supporto di KSOM (mKSOM) modificato per la coltura embrionale, composto da 95 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 0,35 mM KH2PO4, 0,2 mM MgSO4 · 7H2O, 1,71 mM CaCl2 · 2H2O, 0,2 mM P (+)-glucosio, 0,2 mM sodio piruvato, L-Glutammina, polivinilpirrolidone (PVP), mM 25,07 NaHCO3, 1,0 g/L di 1.0 mM 10 mM DL-lattato di sodio 0,05 g/L penicillina e streptomicina in acqua sterile 0,05 g/L. Preparare il supporto di tamponata Hepes CZB (HCZB) per la manipolazione dell’embrione, costituito da 81,5 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,7 mM CaCl2 · 2H2O, 1,18 mM MgSO4 · 7H2O, 1,18 mM KH2PO4, 0,11 mM EDTA · 2NA, 36,1 mM DL-lattato di sodio, 5,55 mM P (+)-glucosio, 0,025 g/mL penicillina, 0,035 g/L streptomicina, 0,014 mM rosso fenolo, alcool polivinilico 1,0 g/L, 5.0 mM NaHCO3e 20,0 mM Hepes sale di sodio in acqua sterile. Preparare il supporto di attivazione per l’attivazione degli ovociti: mKSOM supplementato con 50 nM TSA, 2 mM EGTA, 5 µ g/mL citocalasina B (CB) e 5 mM SrCl2. 2. preparazione di deionizzata albumina di siero bovino (dBSA) Sciogliere 1,2 g di albumina di siero bovino (BSA) in 10 mL di acqua sterile a temperatura ambiente (una concentrazione finale di 12%). Aggiungere circa 0,12 g di perle di resina di scambio ionico misto al precedente preparato 12% di BSA in acqua sterile a temperatura ambiente con agitazione delicata. Quando le perline cambia colore dal blu-verde all’oro, recuperare la soluzione surnatante con una pipetta. Quindi sostituire le perline con il fresco (Figura 1).Nota: La sostituzione di perline normalmente viene eseguita una sola volta. Forse richiede poche sostituzioni di deionizzazione completa. Solo come una guida, se il colore delle perle rimane invariato da blu-verde all’oro, indica che lo scambio ionico è completo. Recuperare la soluzione dopo la conferma che non esiste nessun cambiamento di colore nelle perle.Nota: Se la soluzione recuperata diventa torbida, centrifugare per impedire l’intasamento del filtro (175 x g, 5 min). Integrare il recuperato la soluzione con 250 µ l di 10,5% NaHCO3.Nota: Questo processo è inteso per la soluzione di dBSA neutralizzare condizione di pH. Tuttavia, NaHCO3 può essere superflua. Sterilizzare il supernatante utilizzando un filtro da 0,45 µm e conservare a-20 ° C come soluzione di riserva dBSA. 3. ovocita collezione Nota: Tutti i topi sono stati mantenuti in camere con aria condizionate e luce controllata. Super-ovulare ogni mouse B6D2F1 femminile (età compresa tra 8-10 settimane) tramite l’iniezione intraperitoneale di 7,5 UI di gonadotropina del siero di cavalla gravida (PMSG) e 7,5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG) 48 h dopo l’iniezione di PMSG. Eseguire l’eutanasia di dislocazione cervicale 14-16 h dopo l’iniezione di hCG. Incise l’addome per accedere il tratto riproduttivo usando tecniche di dissezione standard13. Brevemente, pizzicare la pelle e fare una piccola incisione laterale al midline con le forbici. Tenere la pelle saldamente sopra e sotto l’incisione e tirare la pelle verso la testa e la coda. Tagliare il peritoneo utilizzando le forbici, spingere via le bobine dell’intestino e confermare la presenza di due corni dell’utero, ovidotti e le ovaie. Estirpare ovidotti con piccole Forbici rette e pinzette, posto su un foglio di carta da filtro per pulire il sangue dalla superficie. Impostare gli ovidotti in olio minerale. Quindi, tagliare l’ampolla dell’ovidotto utilizzando aghi di dissezione e spostare i complessi cumulo-ovocita proveniente dal ampulla dell’ovidotto in gocce per 200 µ l di HCZB con 0,1% ialuronidasi. Incubare per 5 minuti su una piastra riscaldante.Attenzione: Un’esposizione di più di 10 min in mezzo HCZB con 0,1% ialuronidasi sarebbe dannosa per gli ovociti. Confermare che le cellule del cumulo vengono rilasciate dai complessi cumulo-ovocita sotto un microscopio stereoscopico, trasferimento seconda metafase meiotica (MII) fase ovociti con alcune cellule del cumulo restante per mKSOM media contenenti 0,3% dBSA. Quindi, lavare gli ovociti di fase MII quattro volte pipettando su e giù (usando una pipetta di < 100 µm di diametro interno) in mKSOM media contenenti 0,3% dBSA per staccare le restanti cellule del cumulo.Nota: L’uso di una pipetta piccola facilita il distacco delle cellule del cumulo. Incubare gli ovociti di fase di Mll in mKSOM Media contenente dBSA 0,3% a 37 ° C inferiore al 5% CO2 incubatrice fino al enucleation.Nota: È consigliabile una piccola pipetta con un diametro che è leggermente superiore a quello dell’ovocita. 4. preparazione delle cellule erogarici per trasferimento nucleare Dopo passi 3,3-3,5, ovociti decumulati sono isolati dai complessi cumulo-ovocita. Trasferire una piccola quantità (circa 2 µ l) delle restanti cellule del cumulo dislocate dai complessi cumulo-ovocita nel mezzo di HCZB con l’ialuronidasi 0,1% a mezzo HCZB con 6% dBSA utilizzando una pipetta sotto un microscopio stereoscopico. Posizionare le cellule del cumulo in mezzo HCZB con 6% dBSA sulla piastra riscaldante a 37 ° C fino a quando necessario per SCNT.Nota: Quando le cellule del fibroblasto (ad es., cellule dei fibroblasti embrionali murini) sono usate come cellule del donatore, staccare le cellule da un piatto di coltura del tessuto e centrifugare a loro in una pallina. Risospendere il pellet di cellule nel mezzo HCZB che contiene 6% dBSA. 5. enucleazione di ovociti Preparare il supporto di PVP di 9% aggiungendo 0,9 g PVP a 10 mL di terreno di HCZB, conservare in frigorifero durante la notte (4 ° C) e poi sterilizzarlo usando un filtro da 0,45 µm. Preparare soluzioni «stock» CB (concentrazione di 1 mg/mL) con l’aggiunta di 5 mg di CB a 5 mL di solfossido dimetilico (DMSO). Diluire la soluzione di riserva CB con il mezzo di HCZB (una concentrazione finale di 5 µ g/mL) e utilizzare come soluzione di enucleazione. Lavare gli ovociti di fase di Mll in 20 µ l di terreno HCZB contenente 5 µ g/mL CB (soluzione di enucleazione) di inspirare ed espirare attraverso la pipetta sterilizzata (diametro interno: 150 µm a 200 µm). Ripetere il lavaggio cinque volte. Attendere circa 10 min sulla piastra di riscaldamento in soluzione di enucleazione prima di iniziare il processo di enucleazione. Preparare la camera di enucleazione come mostrato nella Figura 2A. Trasferire gli ovociti di Mll alla camera di enucleazione di inspirare ed espirare con la pipetta (diametro interno: 150 µm a 200 µm); mettere 4 µ l di soluzione di enucleazione e coprire la camera con olio minerale.Nota: Invece di una camera, una cover di un 60mm di Petri può essere utilizzata. Identificare i mandrini e cromosomi dell’ovocita fase MII al microscopio (400 X) a temperatura ambiente. Orientare l’ovocita di fase di Mll con il primo globulo polare pronunciato, in modo che il posizionamento del mandrino e del cromosoma è alle 3 o 9 posizione (Figura 2B) usando una pipetta di supporto e la micropipetta.Nota: Il microscopio utilizzato ha lenti di ingrandimento di 400 volte in totale. Inoltre, la lente dell’obiettivo Nardi è 5 X / 0.12 e 40 X / 0.55. L’azionamento di impulso piezo-elettrici della pipetta consente rapida perforazione della zona pellucida. Inoltre, un sistema laser (ad esempio, XYClone) è anche utilizzabile per la perforazione della zona pellucida al posto del sistema di azionamento piezo-elettrico. Impostare l’intensità di stimolazione piezo per 3-6 e drill per la zona pellucida usando una pipetta di micromanipolazione (7-8 µm diametro interno estremità piatta in punta) con l’impulso di piezo di guida. Dopo l’apertura di un foro nella zona pellucida, completamente enucleare i mandrini e cromosomi con una minima quantità di citoplasma (Figura 2).Nota: Durante questo processo, gli ovociti tendono a strettamente attaccare sul fondo del piatto o dispensare dovuto il mezzo senza BSA14. Entro 10 minuti, deve essere completato il processo di enucleazione e gli ovociti enucleated devono essere restituiti nell’incubatore. Il numero appropriato di ovociti che possono essere manipolate in un enucleation è tra 10 e 20. Per grandi lotti di ovociti, si ripete la procedura di enucleazione. Confermare l’assenza dei cromosomi nel citoplasma sotto luce visibile (Figura 2, medio), quindi lavare accuratamente gli ovociti enucleated in mKSOM medium contenente 0,3% dBSA carente CB. Introdurre il piatto nell’incubatore a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 fino a quando la fusione cellulare.Nota: Dopo il enucleation, rimosso da ooplasma citoplasma contiene i mandrini e cromosomi. 6. fusione di una cellula donatrice e un ovocita Enucleated Preparazione di HVJ-E Aggiungi 260 µ l di soluzione di sospensione HVJ-E ghiacciata a liofilizzato HVJ-E (da kit, vedere la Tabella materiali) e pipettare su e giù fino a quando completamente sospesa.Nota: La quantità appropriata di liofilizzato HVJ-E viene preparata in una bottiglia, e 260 µ l HVJ-E sospensione soluzione è incluso nel kit. Preparare 5 aliquote µ l della soluzione HVJ-E e quindi conservare a-80 ° C fino a fusione cellulare.Attenzione: Trattare con cura il HVJ-E su ghiaccio, poiché è sensibile alla temperatura. Dopo il completamento dell’esperimento, in modo appropriato autoclave HVJ-E materiali e contenitori per inattivare completamente componenti virus. Fusione cellulare Diluire il 5 µ l di soluzione di HVJ-E con 20 µ l di tampone di fusione la cella immediatamente prima dell’uso. Posto la soluzione diluita di HVJ-E su ghiaccio fino all’utilizzo.Nota: Il buffer di fusione delle cellule è incluso nel kit HVJ-E. Preparare la camera di fusione delle cellule come mostrato in Figura 3A. Trasferire gli ovociti enucleated a terreno di HCZB sulla camera di fusione di cella usando la pipetta (diametro interno: 150 µm a 200 µm); posto 4 µ l di ciascuna soluzione (mezzo HCZB che contiene 6% -BSA per le cellule erogarici, soluzione HVJ-E, HCZB medio, 9% PVP in mezzo HCZB) e coprire la camera con circa 1 mL di olio minerale.Nota: Il numero appropriato di enucleated ovociti che vengono trasferiti alla camera per manipolazione durante una procedura di fusione delle cellule è da 5 a 30. Per grandi lotti di ovociti, si ripete la procedura di fusione delle cellule. Invece di camera, una cover di 60 mm di Petri può essere utilizzata, se disponibile. Posizionare gli ovociti enucleated nel mezzo di HCZB sotto un microscopio a 400 X magnificationat temperatura. Aspirare le cellule del donatore con la pipetta di micromanipolazione (6-7 µm diametro interno estremità piatta in punta) e di espellere le cellule in soluzione di sospensione HVJ-E. Quindi aspirare le cellule del cumulo uno per uno con la soluzione di sospensione HVJ-E altrettanto essere separato da altro, consentendo la fusione cellulare seriale. Tenere gli ovociti enucleated medium HCZB facendo uso di una pipetta di supporto. Forare la zona pellucida con la pipetta di micromanipolazione con l’impulso di piezo (intensità di 3-6, velocità di 2-3). Dopo aver aperto il foro nella zona pellucida, mettere una cella di cumulus strettamente alla membrana dell’ovocita, insieme con la soluzione di sospensione HVJ-E con un volume di 5 volte il volume di una cella di cumulus, senza passare attraverso la membrana dell’ovocita.Nota: Preparare 6-7 punte di estremità piatta di µm di diametro interno di pipette di micromanipolazione per le cellule del cumulo. Pipette devono essere lavati regolarmente usando 9% PVP mezzo per mantenere il rilascio regolare delle cellule. 6.2.3 –passi-6.2.5 devono concludersi entro 10 min, o l’efficienza di fusione cellulare sarà inferiore. Attività di fusione della membrana di HVJ-E è inattivato in autoclave, trattamento con etanolo al 70%, o un detergente. Dopo l’esperimento, la soluzione di HVJ-E deve essere opportunamente smaltita. Dopo manipolazione di fusione cellulare, prontamente trasferire gli ovociti mKSOM media contenenti 0,3% dBSA e spostare in un incubatore a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 per 1 h. 7. attivazione del ricostruito ovociti e trattamento con tricostatina A e vitamina C Preparazione di TSA Pipettare 5 mM TSA soluzione in 3 aliquote µ l e conservare la soluzione a-20 ° C. Aggiungere 2,5 µ l di soluzione madre di TSA di 5 mM a 1 mL di DMSO (a una concentrazione di 12,5 µM). Diluire 8 µ l di 12,5 µM TSA soluzione in 2 mL di attivazione medio e medio mKSOM (una concentrazione finale di 50 nM). Preparazione di VC Aggiungere 1 mg di VC in 1 mL di acqua sterile privo di endotossina e conservare a-20 ° C. Aggiungere la soluzione di riserva di VC mKSOM medio (una concentrazione finale di 10 µ g/mL). Attivazione degli ovociti ricostruiti Un’ora dopo la fusione cellulare, controllare la condensazione prematura dei cromosomi (PCC) in ovociti ricostruiti (Figura 3B) utilizzando un microscopio (400 X). Trasferire gli ovociti ricostruiti al mezzo di attivazione (Vedi punto 1.3) contenenti TSA e incubare per 6 h a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 nell’aria (Figura 3). Osservare la formazione di pro-nuclei negli embrioni SCNT, quindi applicare 2 ore di trattamento TSA in mKSOM media contenenti 0,3% dBSA (Figura 2). Trasferire gli embrioni trattati con TSA mKSOM supplementato con VC e incubare per 7 h, come illustrato nella Figura 3D. Dopo 7 h del trattamento VC, trasferire gli embrioni trattati con VC mKSOM media contenenti 0,3% dBSA e incubare per 4 giorni a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 nell’aria.Nota: Per produrre topi clonati, trasferire gli embrioni morfologicamente normale fase 2-cell in ovidotti di topi femminili pseudo-incinto (MCH(ICR)) il giorno quando un plug vaginale viene trovato (giorno 0,5 di pseudogravidanza)15. Dopo 19,5 giorni, il numero di siti di impianto ed i neonati è registrato dopo la sezione cesarean.