Kombinatorische Behandlung von Trichostatin A und Vitamin C verbessert die Effizienz des Klonens Mäuse durch Kerntransfer somatischer Zellen

Alle tierische Verfahren entsprach den Richtlinien der Kindai Universität für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Vorbereitung von Nährmedien Bereiten Sie das modifizierte KSOM (mKSOM)-Medium für Embryonenkultur, bestehend aus 95 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 0,35 mM KH2PO40,2 mM MgSO4 · 7H2O, 1,71 mM CaCl2 · 2H2O, 0,2 mM D (+)-Glukose, 0,2 mM Natrium Pyruvat, 1,0 mM L-Glutamin, 1,0 g/L Polyvinylpyrrolidon (PVP), 25,07 mM Nahco33, 10 mM Natrium DL-Laktat, 0,05 g/L Penicillin und 0,05 g/L Streptomycin in sterilem Wasser. Vorbereiten der Embryo Manipulation, bestehend aus 81,5 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,7 mM CaCl2 · Mediums Hepes gepufferten CZB (HCZB) 2H2O, 1,18 mM MgSO4 · 7H2O, 1,18 mM KH2PO4, 0,11 mM EDTA · 2NA, 36,1 mM Natrium DL-Laktat, 5,55 mM D (+)-Glukose, 0,025 g/mL Penicillin 0,035 g/L Streptomycin, 0,014 mM Phenol rot, 1,0 g/L Polyvinylalkohol, 5,0 mM Nahco33und 20,0 mM Hepes Natriumsalz in sterilem Wasser. Eizelle Aktivierung Aktivierung Medium vorbereiten: mKSOM Medium mit 50 nM TSA, 2 mM EGTA 5 µg/mL Cytochalasin B (CB) und 5 mM SrCl2ergänzt. 2. Vorbereitung der deionisiertes Rinderserumalbumin (dBSA) Lösen Sie 1,2 g von Rinderserumalbumin (BSA) in 10 mL sterilem Wasser bei Raumtemperatur (eine Endkonzentration von 12 %). Fügen Sie ca. 0,12 g gemischte Ionenaustausch-Harz Perlen zu den oben genannten 12 % der BSA in sterilem Wasser bei Raumtemperatur unter schonenden rühren vorbereitet. Wenn die Perlen Farbwechsel von blau-grün, Gold, die überstehende Lösung mit einer Pipette zu erholen. Ersetzen Sie die Perlen mit dem frischen, (Abbildung 1).Hinweis: Die Ersetzung der Perlen wird normalerweise nur einmal durchgeführt. Es erfordert möglicherweise ein paar Ersatz zu vollständigen Entmineralisierung. Nur als Orientierungshilfe, wenn die Farbe der Perlen von unverändert blau-grün, Gold, es zeigt, dass Ionenaustausch ist abgeschlossen. Die Lösung nach der Bestätigung, dass gibt es keinen Farbwechsel in den Perlen zu erholen.Hinweis: Wenn die wiederhergestellten Lösung trüb wird, Zentrifugieren Sie um zu verhindern, dass Verstopfung des Filters (175 X g, 5 min). Der wiederhergestellten ergänzen die Lösung mit 250 µL von 10,5 % Nahco33.Hinweis: Dieser Prozess richtet sich an die dBSA Lösung pH Zustand zu neutralisieren. Nahco33 kann jedoch entbehrlich. Den Überstand mit einem 0,45-µm-Filter zu sterilisieren und bei-20 ° C als dBSA Stammlösung speichern. 3. die Eizellenentnahme Hinweis: Alle Mäuse waren gepflegt in lichtgesteuerten und klimatisierte Zimmer. Super-Eisprung jeden weiblichen B6D2F1 Maus (im Alter von 8 bis 10 Wochen) durch intraperitoneale Injektion von 7,5 IE trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG) und 7,5 IU humanes Choriongonadotropin (hCG) 48 h nach der PMSG-Injektion. Euthanasie durch zervikale Dislokation 14-16 Uhr durchzuführen nach der hCG-Injektion. Einschneiden des Bauches um die Fortpflanzungsorgane mit standard Dissektion Techniken13zuzugreifen. Kurz gesagt, drücken Sie die Haut und machen Sie einen kleinen seitlichen Einschnitt an der Mittellinie mit einer Schere. Halten Sie die Haut fest oberhalb und unterhalb der Schnitt und ziehen Sie die Haut in Richtung Kopf und Schweif. Schneiden Sie das Bauchfell mit einer Schere, schieben Sie die Windungen des Darms aus dem Weg und bestätigen Sie das Vorhandensein von zwei Hörner der Gebärmutter, der Eileiter und die Eierstöcke. Auszurotten Sie röhrenförmig mit kleinen geraden Scheren und Pinzetten, legen Sie auf ein Blatt Filterpapier, das Blut von der Oberfläche wischen. Legen Sie die Eileiter in Mineralöl. Dann der Ampulle des Eileiters mit Dissektion Nadeln zerschnitten Sie, und verschieben Sie die Cumulus-Eizelle komplexe aus der Ampulle des Eileiters in 200 µL Tropfen des HCZB Mediums mit 0,1 % Hyaluronidase. 5 min auf einer Warmhalteplatte inkubieren.Achtung: Eine Ausstellung von mehr als 10 min in HCZB Medium mit 0,1 % Hyaluronidase wäre schädlich für die Eizellen. Bestätigen Sie, dass die kumuluszellen von Cumulus-Eizelle komplexe unter einem Stereomikroskop Transfer zweiten meiotischen Metaphase (MII) Bühne Eizellen mit einigen verbliebenen kumuluszellen, mKSOM mittlere mit 0,3 % dBSA freigegeben werden. Dann waschen die MII Bühne Eizellen viermal durch pipettieren rauf und runter (mit einer Pipette der < 100 µm Innendurchmesser) in mKSOM mittlere mit 0,3 % dBSA zum Lösen der verbleibenden kumuluszellen.Hinweis: Die Verwendung von einer kleinen Pipette erleichtert die Ablösung von der kumuluszellen. Inkubieren Mll Bühne Eizellen in mKSOM mittlere mit 0,3 % dBSA bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 Inkubator bis Enukleation.Hinweis: Eine kleine Pipette mit einem Durchmesser, der etwas größer ist als das der Eizelle wird empfohlen. 4. Vorbereitung der Spenderzellen Kerntransfer Nach Schritten 3.3-3.5 sind entblößte Eizellen von der Cumulus-Eizelle komplexe isoliert. Eine kleine Menge (ca. 2 µL) der verbleibenden Cumulus Zellen verteilt von Cumulus-Eizelle-komplexe in HCZB Medium mit 0,1 % Hyaluronidase, HCZB Medium mit 6 % dBSA mithilfe einer Pipette unter einem Stereomikroskop zu übertragen. Legen Sie die kumuluszellen in HCZB Medium mit 6 % dBSA auf die Warmhalteplatte bei 37 ° C bis für SCNT benötigt.Hinweis: Wenn fibroblastenzellen (zB., murinen embryonalen fibroblastenzellen) sind als Spenderzellen, lösen die Zellen aus einer Gewebekultur Schüssel und Zentrifugieren sie in einem Pellet. Aufzuwirbeln Sie das Pellet von Zellen in HCZB 6 % dBSA-haltigem Medium. 5. Enukleation der Eizellen 9 % PvP-Medium durch Zugabe von 0,9 g PVP auf 10 mL HCZB Medium vorbereiten, halten im Kühlschrank über Nacht (4 ° C) und Sterilisieren Sie es mit einem 0,45 µm-Filter. Bereiten Sie CB-Stammlösungen (Konzentration von 1 mg/mL vor) durch Zugabe von 5 mg von CB bis 5 mL des Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Verdünnen Sie die CB-Stammlösung mit HCZB Medium (eine Endkonzentration von 5 µg/mL) und als Enukleation Lösung verwenden. Waschen Sie die Mll Bühne Eizellen in 20 µL des HCZB Mediums mit 5 µg/mL CB (Enukleation Lösung) von ein- und Ausatmen durch die sterilisierten Pipette (Innendurchmesser: 150 µm bis 200 µm). Wiederholen Sie der Waschvorgang fünf Mal. Warten Sie ca. 10 min auf die Warmhalteplatte in Enukleation Lösung, bevor der Enukleation beginnen. Bereiten Sie die Enukleation Kammer, wie in Abbildung 2Agezeigt. Die Mll Eizellen zur Enukleation Kammer durch ein- und ausatmen mit der Pipette zu übertragen (Innendurchmesser: 150 µm bis 200 µm); Legen Sie 4 µL Enukleation Lösung und bedecken Sie die Kammer mit Mineralöl.Hinweis: Anstelle einer Kammer kann eine Abdeckung von 60 mm Petrischale verwendet werden. Identifizieren Sie die Spindeln und die Chromosomen der MII Bühne Eizelle unter dem Mikroskop (400 X) bei Raumtemperatur. Ausrichten der Mll Bühne Eizelle mit der ausgeprägten erste Polkörper, sodass die Positionierung der Spindel und Chromosom bei der 3 oder 09:00 (Abb. 2 b) Position mit einer haltepipette und Mikropipette ist.Hinweis: Das Mikroskop verwendet hat insgesamt Linsen 400 X Vergrößerung. Außerdem ist das Objektiv N.A 5 X / 0,12 und 40 X / 0,55. Die Piezo Puls der Pipette Führerscheine schnelles Bohren von der Zona Pellucida. Darüber hinaus ist ein Laser-System (z.B.XYClone) auch verwendbar für das Bohren von der Zona Pellucida anstelle von Piezo-Antriebssystem. Die Piezo-Impulsintensität auf 3-6, und Bohren Sie, die Zona Pellucida mit einer Pipette Mikromanipulation (7-8 µm Innendurchmesser Wohnung endete Tip) mit dem Piezo-Puls fahren. Nach dem Öffnen ein Loch in die Zona Pellucida, völlig enucleate Spindeln und Chromosomen mit einer minimalen Menge von Zytoplasma (Abbildung 2).Hinweis: Während dieses Vorgangs tendenziell Eizellen straff befestigen an der Unterseite der Schüssel oder pipette durch das Medium ohne BSA14. Innerhalb von 10 Minuten muss die Enukleation abgeschlossen, und die entkernte Eizellen in den Inkubator zurückgegeben werden müssen. Die entsprechende Anzahl an Eizellen, die in eine Enukleation manipuliert werden kann liegt zwischen 10 und 20. Für größere Chargen von Eizellen ist die Enukleation Prozedur wiederholt. Bestätigen Sie das Fehlen von Chromosomen im Zytoplasma unter sichtbarem Licht (Abbildung 2, Mitte), dann waschen Sie die entkernte Eizellen in mKSOM 0,3 % dBSA fehlt CB-haltigem Medium. Einzuführen, die Schüssel in den Inkubator bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 bis Zellfusion.Hinweis: Nach Enukleation enthält das Zytoplasma vom Spindelapparat entfernt die Spindeln und Chromosomen. 6. Verschmelzung von einem Spender Zelle und eine entkernte Eizelle Vorbereitung der HVJ-E Lyophilisierten HVJ-E 260 µL eiskalte HVJ-E Aussetzung Lösung hinzufügen (aus dem Kit, siehe die Tabelle der Materialien) und rauf und runter bis vollständig suspendiert.Hinweis: Die entsprechende Menge an gefriergetrockneten HVJ-E ist bereit, in eine Flasche und 260 µL HVJ-E Aussetzung Lösung ist im Kit enthalten. 5 µL-Aliquots der HVJ-E Lösung vorzubereiten, und dann bei-80 ° C bis zur Zellfusion lagern.Achtung: Sorgfältig zu behandeln HVJ-E auf Eis, da es temperaturempfindlich ist. Nach Abschluss des Experiments, entsprechend Autoklaven HVJ-E Materialien und Container, Virus-Komponenten vollständig zu inaktivieren. Zellfusion 5 µL HVJ-E Lösung mit 20 µL des Puffers Cell Fusion unmittelbar vor Gebrauch zu verdünnen. Legen Sie die verdünnte Lösung HVJ-E auf dem Eis bis zur Verwendung.Hinweis: Die Zelle-Fusion-Puffer ist im HVJ-E-Kit enthalten. Bereiten Sie der Zelle Fusion Kammer, wie in Abbildung 3Agezeigt. Die entkernte Eizellen zu HCZB Medium zu übertragen, auf der Zelle-Fusion-Kammer mit der Pipette (Innendurchmesser: 150 µm bis 200 µm); Platz 4 µL jeder Lösung (HCZB Medium mit 6 % -BSA für Spenderzellen, HVJ-E Lösung, HCZB Mittel, 9 % PVP in HCZB Medium) und die Kammer mit etwa 1 mL von Mineralöl zu decken.Hinweis: Die entsprechende Anzahl an entkernte Eizellen, die in der Kammer für Manipulationen während einer Zelle Fusion Verfahren übertragen werden ist von 5 bis 30. Für größere Chargen von Eizellen wird die Zelle Fusion Vorgang wiederholt. Anstelle von Kammer kann eine 60 mm Petrischale Decke verwendet werden, falls vorhanden. Legen Sie die entkernte Eizellen in HCZB Medium unter dem Mikroskop bei 400 X magnificationat Raumtemperatur. Aspirieren Sie die Spenderzellen mit der Mikromanipulation Pipette (6-7 µm Innendurchmesser Wohnung beendet Tipp) und vertreiben Sie Zellen in HVJ-E Aussetzung Lösung zu. Dann Aspirieren Sie kumuluszellen eins nach dem anderen mit der HVJ-E Aussetzung Lösung gleichermaßen voneinander getrennt werden serielle Zellfusion ermöglichen. Halten Sie die entkernte Eizellen in HCZB Medium mit einer haltepipette. Bohren Sie die Zona Pellucida mit der Mikromanipulation Pipette mit dem Piezo-Puls (Intensität der 3-6, Geschwindigkeit von 2-3). Legen Sie nach der Eröffnung des Lochs in der Zona Pellucida eine Cumulus-Zelle eng an die Eizelle Membran, zusammen mit HVJ-E Aussetzung Lösung mit einem Volumen 5-Mal das Volumen einer Cumulus-Zelle, ohne den Umweg über die Membran der Eizelle.Hinweis: Bereiten Sie 6-7 µm Innendurchmesser Wohnung endete Spitzen der Mikromanipulation Pipetten kumuluszellen vor. Pipetten müssen regelmäßig mit 9 % PvP-Medium für die Aufrechterhaltung der glatten Zelle Release gewaschen werden. Schritte 6.2.3 – 6.2.5 müssen innerhalb von 10 min fertig sein, oder die Effizienz der Zellen-Schmelzverfahren wird niedriger sein. Membran-Fusion-Aktivität des HVJ-E ist durch Autoklavieren, Behandlung mit Reinigungsmittel oder 70 % Ethanol inaktiviert. Nach dem Experiment muss die HVJ-E Lösung entsprechend entsorgt werden. Nach Manipulation der Zellfusion, umgehend die Eizellen auf mKSOM mittlerer mit 0,3 % dBSA übertragen und verschieben in einem Inkubator bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 für 1 h. (7) Aktivierung des rekonstruierten Eizellen und Behandlung mit Trichostatin A und Vitamin C Vorbereitung der TSA Verzichten Sie 5 mM TSA Lösung in 3 µL-Aliquots zu, und speichern Sie die Lösung bei-20 ° C. 1 mL DMSO (eine Konzentration von 12,5 µM) 2,5 µL der Stammlösung 5 mM TSA hinzufügen. Verdünnen Sie 8 µL 12,5 µM-TSA-Stammlösung in 2 mL der Aktivierung und mKSOM Medium (eine Endkonzentration von 50 nM). Vorbereitung der VC VC 1 mg in 1 mL sterilem Endotoxin-freies Wasser hinzufügen und speichern bei-20 ° C. Die VC-Stammlösung zu mKSOM Medium (eine Endkonzentration von 10 µg/mL) hinzufügen. Aktivierung des rekonstruierten Eizellen Eine Stunde nach Zellfusion, überprüfen Sie die vorzeitige Chromosom Kondensation (PCC) in der rekonstruierten Eizellen (Abb. 3 b) unter Verwendung eines Mikroskops (400 X). Die rekonstruierten Eizellen auf die Aktivierung Medium übertragen (siehe Punkt 1.3) mit TSA und inkubieren Sie für 6 h bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 in Luft (Abbildung 3). Beobachten Sie die Bildung der Pro-Kerne in die SCNT Embryonen zu, dann gelten Sie 2 weitere Stunden der TSA Behandlung in mKSOM mittlere mit 0,3 % dBSA (Abbildung 2). Übertragen Sie die TSA-behandelten Embryonen auf mKSOM Medium ergänzt mit VC und inkubieren Sie 7 h, wie in Abbildung 3Dgezeigt. Nach 7 h der VC-Behandlung, die VC-behandelten Embryonen auf mKSOM mittlerer mit 0,3 % dBSA übertragen und inkubieren Sie für 4 Tage bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 in die Luft.Hinweis: Um geklonte Mäuse zu erzeugen, übertragen Sie morphologisch normalen 2-Zellstadium Embryonen in den Eileiter der Pseudo-schwangeren weiblichen Mäusen (MCH(ICR)) am Tag, wenn ein vaginale Stecker (Tag 0,5 der scheinträchtigkeit)15gefunden wird. Nach 19,5 Tagen erfasst die Anzahl der Implantation Websites und Neugeborenen nach Kaiserschnitt.